沉默GRP78表达增强HOS细胞对MPPα-PDT敏感性的研究①

左 强 欧云生 余浩洋 钟申熹 张木子（重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆400016）

骨肉瘤是青少年常见的骨原发恶性肿瘤之一，伴随着医疗技术的进步及新辅助治疗出现，患者的总体生存率有所提高，但骨肉瘤复发和转移仍是治疗的难题［1-2］。光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）作为一种治疗时间窗短、毒副反应小、可重复治疗的新型治疗恶性肿瘤的方法，已广泛运用于临床相关恶性肿瘤的治疗［3-4］。

葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是一种关键的内质网管腔内分子伴侣，具有强大的抗凋亡特性，在多种恶性肿瘤中高表达，与肿瘤的增殖和存活密切相关［5-7］；此外，有研究表明，GRP78也是肿瘤细胞抗性的关键调节因子，与肿瘤的耐药、复发及转移密切相关［8-9］。在乳腺癌及结肠癌研究中发现，沉默GRP78表达可增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性［10-11］，但GRP78在PDT治疗骨肉瘤中的研究较少。本研究将运用siRNAGRP78干扰人骨肉瘤细胞HOS中GRP78的表达，并探讨其对焦脱镁叶绿酸-α甲酯介导的光动力疗法（MPPα-PDT）作用下HOS细胞增殖活性、凋亡水平及Wnt通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂 人骨肉瘤HOS细胞株购自中国科学院上海细胞库。焦脱镁叶绿酸-α甲酯（pyropheophorbide-α methyl ester，MPPα）购于美国Sigma公司；胎牛血清、高糖DMEM细胞培养基等均购自美国Gibco公司；胰蛋白酶、Lipo8000TM转染试剂及Hoechst凋亡试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；Annexin V-PI双染检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司；CCK-8试剂盒购自上海MedChemExpress公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；RNA提取试剂购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒购自上海东洋纺生物科技公司；PCR检测试剂盒购自美国应用生物系统公司；干扰GRP78基因（siRNA-GRP78）由上海汉恒生物科技有限公司合成，序列如下：正义链5'-CCAAAGACGCUGGAACUAUTT-3'，反 义 链5'-AUAGUUCCAGCGUCUUUGGTT-3'，siRNA阴性对 照，序列如下：正义链5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'，反义链5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'。兔抗人GRP78多克隆抗体、兔抗人βactin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体均购自中国武汉三鹰公司；兔抗人Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3单克隆抗体均购自美国CST公司；兔抗人Ki67、兔抗人PCNA、兔抗人PKT、兔抗人GSK3β、兔抗人β-catenin多克隆抗体购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司；兔抗人P-AKT、兔抗人P-GSK3β均购自中国博士德生物工程有限公司；Cy3标记的羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.1.2 仪器 光动力治疗仪购自重庆京渝激光生物研究所；流式细胞仪购自美国B&D Biosciences公司；倒置荧光显微镜、正置荧光显微镜均购自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 人骨肉瘤HOS细胞的培养 人骨肉瘤HOS细胞株用含有0.1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素与10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基培养，置于37℃、5%CO2的孵箱中避光培养，待细胞密度达60%～70%时，常规传代。

1.2.2 PDT处理HOS细胞 取对数生长期的人骨肉瘤HOS细胞，常规胰酶消化，按实验分组传代。待细胞生长密度为50%～60%时，避光加终浓度为0.15 μmol/L的光敏剂MPPα，继续避光培养20 h，经波长630 nm、40 mW/cm2的连续输出方式，光照120 s，继续在37℃、体积分数为5%CO2的培养箱中根据实验分组进行避光孵育［12］。

1.2.3 Hoechst染色检测细胞凋亡 取对数生长期的人骨肉瘤HOS细胞，常规胰酶消化，6孔板中按Control组、MPPα组、LED组、MPPα-PDT 24 h组分组。MPPα-PDT处理后，根据操作说明每孔加入Hoechst固 定 液 固 定15 min，PBS洗 净，每 孔 加 入Hoechst33342染料1 ml染色5 min，PBS洗净残余染料，倒置荧光显微镜观察各组细胞细胞核变化。

1.2.4 脂质体介导siRNA-GRP78转染HOS细胞取对数生长期的HOS细胞，接种于6孔板，分组如下：Control组、siRNA-NC组、siRNA-GRP78组，取15 ml离心管，每孔HOS细胞加入125 μl DMEM培养基，加入100 pmol siRNA，混匀，加入4 μl Lipo8000TM转染试剂，室温静置20 min，最后每孔加入125 μl上述混合液，轻轻摇匀，转染6 h，更换为完全培养基，72 h后可行下一步实验。

1.2.5 qPCR法检测GRP78 mRNA的表达水平细胞转染siRNA-GRP78 72 h后，Trizol法提取RNA，逆转录cDNA，采用10 μl上样体系依次上样，运用以下上机程序：95℃、30 s，共1个循环；90℃、5 s，60℃、30 s，65℃、5 s，共40个循环。以β-actin为内参，引物序列分别为：β-actin上游：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'；GRP78上游：5'-CACGCCGTCCTATGTCGC-3'，下 游：5'-AAATGTCTTTGTTTGCCCACC-3'。采用2-ΔΔCt法进行标准化，并计算GRP78基因mRNA的相对表达量。

1.2.6 CCK-8法检测细胞增殖活性 取对数生长期的细胞，按5 000个/孔接种于96孔板。分为Control组、siRNA-GRP78组、siRNA-GRP78+MPPα-PDT组及MPPα-PDT组，分别于处理后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h检测HOS细胞增殖活性。根据CCK-8检测试剂盒操作说明按每孔加入10 μl CCK-8溶液和90 μl DMEM培养液混合液，孵育箱中反应1 h。用酶标仪于波长为450 nm处测定各孔的OD值。每组设置5个复孔，重复3次，取平均值计算各组细胞的存活率。细胞存活率（%）=（实验组平均OD值-调零孔OD值）/（空白组平均OD值-调零孔OD值）×100%。

1.2.7 Western blot检测GRP78蛋白、凋亡相关蛋白及Wnt通路相关蛋白表达 取对数生长期的骨肉瘤HOS细胞，按1.2.6中方法对细胞进行分组，行相关处理后提取细胞蛋白。BCA试剂盒检测蛋白浓度，Western blot检测相关蛋白（β-catenin、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β）表达。Image Lab 5.2.1软件分析目的条带，以目标蛋白与β-actin灰度值比值作为目标蛋白相对表达量。

1.2.8 流式细胞术检测HOS骨肉瘤细胞凋亡率取对数生长期的HOS细胞，按1.2.6中方法对细胞进行分组，行相应处理后，PBS缓冲液洗3次，胰酶消化，离心，弃上清液，收集细胞沉淀，每组收集3个批次细胞样本，Annexin V-PI试剂双染，流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.9 免疫荧光检测GRP78蛋白荧光强度 取对数生长期的HOS细胞，接种于6孔板中25 mm细胞爬片，按1.2.6中方法对细胞进行分组，按1.2.1中方法相应处理，继续避光孵育12 h。4%多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗3次，0.1%TritonX-100破膜15 min，山羊抗兔血清封闭40 min，兔多克隆GRP78抗体稀释后（1∶100）4℃过夜孵育。避光条件下加入Cy3标记的羊抗兔IgG荧光二抗室温下孵育40 min，PBS洗3次，DAPI染核5 min，PBS洗净残余DAPI，封片，正置荧光显微镜观察。采用Image J 1.52e软件进行荧光强度分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0软件统计分析实验数据。每组实验均独立重复3次，数据用±s表示。组内两两比较采用t检验，多组间均数的比较采用方差分析；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MPP α-PDT可诱导HOS细胞发生凋亡Hoechst凋亡染色（图1A）提示，与Control组、LED组、MPPα组相比，MPPα-PDT-24 h组中HOS细胞核可见高亮蓝色以及核碎裂、固缩等细胞凋亡形态学变化。流式细胞术（图1B、C）提示MPPα-PDT 3 h、6 h、12 h、24 h组中凋亡率随时间增加而升高（P＜0.01）。

图1 HOS细胞凋亡形态变化（A）及凋亡率检测（B、C）Fig.1 Detection of morphological changes of HOS cell apoptosis（A）and apoptosis rate（B，C）

2.2 MPPα-PDT可 诱 导HOS细胞GRP78表达增高Western blot（图2）显示，与Control组比较，MPPα-PDT处 理HOS细 胞3 h、6 h、12 h、24 h组GRP78表达水平增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；并且12 h表达量最高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot结果提示，在骨肉瘤HOS细胞中，经过MPPα-PDT处理后，GRP78在12 h表达水平最高。故选用12 h时间点进行下一步实验。

图2 Western blot检测MPPα-PDT处 理后HOS细胞 中GRP78蛋白表达Fig.2 GRP78 protein expression level in HOS cells after MPPα-PDT treatment was detected by Western blot

2.3 siRNA-GRP78有效沉默人骨肉瘤HOS细胞中GRP78的表达Western blot（图3A、B）显示，与Control组比较，siRNA-GRP78组骨肉瘤HOS细胞中GRP78蛋白的表达水平降低（P＜0.05），siRNA-NC组GRP78蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。qPCR法（图3C）显示，与Control组相比，siRNAGRP78组骨肉瘤HOS细胞中GRP78 mRNA的表达水平降低，干扰率约为74.60%（P＜0.05），siRNA-NC组与Control组之间相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。骨 肉 瘤HOS细 胞 中siRNA-GRP78组 对GRP78 mRNA的干扰率约为74.60%。以上结果表明，siRNA-GRP78有效地干扰了HOS细胞中GRP78的表达。

图3 siRNA-GRP78对HOS细胞 中GRP78蛋白和mRNA表达的影响Fig.3 Effect of siRNA-GRP78 on expression of GRP78 protein and mRNA in HOS cells

2.4 沉默GRP78表达降低人骨肉瘤HOS细胞的增殖活性GRP78蛋白免疫荧光（图4A、B）显示，与Control组比 较，siRNA-GRP78组 及siRNA-GRP78+MPPα-PDT组中GRP78平均荧光强度均降低（P＜0.05），MPPα-PDT组中GRP78平均荧光强度增加（P＜0.05）；与MPPα-PDT组比较，siRNA-GRP78+MPPα-PDT组GRP78平均荧光强度降低（P＜0.05）。

CCK-8法（图4C）检测结果表明，与Control组比较，siRNA-GRP78组、MPPα-PDT细胞增殖活性随时间延长而下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与MPPα-PDT组相比，siRNA-GRP78+MPPα-PDT组细胞活性显著降低（P＜0.05）。

Western blot（图4D、E）检测显示，与Control组比较，siRNA-GRP78组、siRNA-GRP78+MPPα-PDT组及MPPα-PDT组中增殖蛋白PCNA、Ki67表达均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与MPPα-PDT组比较，siRNA-GRP78+MPPα-PDT组中PCNA、Ki67蛋白表达下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。以上结果提示，siRNA-GRP78可降低HOS细胞的增殖活性，同时可增强MPPα-PDT对细胞增殖活性的抑制作用。

图4 GRP78表达对HOS细胞增殖活性的影响Fig.4 Effect of expression of GRP78 on proliferation activity of HOS cells

2.5 沉默GRP78表达上调人骨肉瘤HOS骨肉瘤细胞的凋亡水平Western blot（图5A、B）检测显示，与Control组比较，siRNA-GRP78组、MPPα-PDT组及siRNA-GRP78+MPP-PDT组Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3凋亡相关蛋白表达上调（P＜0.05）；与MPPα-PDT组相比，siRNA-GRP78+MPPα-PDT组凋亡相关蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase 3表达都明显上升（P＜0.01）。

图5 各组HOS细胞凋亡相关蛋白的表达及凋亡率检测Fig.5 Detection of expression of apoptosis-related proteins and apoptosis rate of HOS cells

流式细胞仪检测细胞凋亡结果（图5C、D）显示，siRNA-GRP78组HOS细 胞 的 凋 亡 率 为（13.93±1.06）%，高于Control组（5.98±0.51）%（P＜0.05）；siRNA-GRP78+MPPα-PDT组 凋 亡 率 为（51.99±2.15）%，高于MPPα-PDT组（32.19±2.79）%和siRNA-GRP78组（P＜0.05）。以上结果提示沉默GRP78表达增加HOS细胞的凋亡率及凋亡相关蛋白的表达，并且增加MPPα-PDT作用下的细胞凋亡水平。

2.6 沉默GRP78表达可抑制MPPα-PDT诱导HOS细胞中Wnt通路的激活Western blot（图6）检测结果显示，与Control组比较，siRNA-GRP78组中p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β及β-catenin等Wnt通路相关蛋白表达下降（P＜0.05）；与MPPα-PDT组比较，siRNA-GRP78+MPPα-PDT组p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β及β-catenin等Wnt通路相关蛋白表达下降（P＜0.05）。以上结果提示，沉默GRP78表达可有效抑制MPPα-PDT处理后HOS骨肉瘤细胞中Wnt通路的激活。

图6 Western blot检测Wnt通路相关蛋白的表达Fig.6 Expression levels of Wnt pathway related proteins were detected by Western blot

3 讨论

PDT是一种治疗效果显著的新型治疗肿瘤方法，MPPα作为新型的第二代光敏剂，能够特异性富集在肿瘤部位，然后利用特定波长的光照射肿瘤，使光敏剂发生光化学反应，导致肿瘤细胞发生凋亡［13］。肿瘤细胞在受到外界不利刺激后，会迅速诱导内质网应激，激活未折叠蛋白反应，恢复肿瘤细胞内质网微环境的稳定，增强肿瘤细胞对外界刺激的适应性［14-15］。GRP78作为内质网应激的关键调节蛋白，通过维持内质网的钙稳态及控制传感器的激活，调节未折叠蛋白反应，使细胞微环境恢复稳态［16-17］。本研究结果显示，MPPα-PDT作用于HOS细胞后，可诱导HOS细胞发生凋亡，并且能够激活未折叠蛋白反应，使GRP78表达的增加。

GRP78作为一种多功能蛋白折叠伴侣和共受体，具有强大的抗细胞凋亡特性，在人类发育和疾病中起着关键作用，与肿瘤的发生和发展密切相关［18-19］。在肿瘤细胞中，GRP78能够激活“促生存”通路，促进肿瘤细胞增殖、抗凋亡，增强肿瘤细胞对不利刺激的适应性，使肿瘤细胞对放化疗产生抗性［20］。在胰腺导管细胞癌的研究中，肿瘤组织中GRP78表达较高，并与肿瘤的化疗抗性与复发相关［21］。在复发性多形性胶质母细胞瘤的研究中，GRP78表达较高的细胞有更强的增殖与成瘤性［22］。本研究结果显示，siRNA-GRP78沉默HOS骨肉瘤细胞中GRP78表达后，HOS细胞的增殖蛋白及增殖活性下降，凋亡蛋白上调，表明GRP78在HOS细胞中起抗凋亡、促增殖的作用。

GRP78的重要性在各种癌细胞的研究中得到证实，目前认为GRP78主要通过激活经典Wnt信号通路，促进肿瘤的侵袭与转移［23-24］。在肝癌中发现，GRP78通过靶向LRP6激活Wnt信号通路，促进肝癌的侵袭与转移［25］。在结肠癌中发现，沉默GRP78可以通过干扰Wnt配体的糖基化在体外抑制Wnt信号，从而增强结肠癌干细胞对化疗药的敏感性［26］。在乳腺癌中发现，乳腺癌细胞增殖和迁移与Wnt信号通路激活相关，并且以GRP78为靶点的药物异甘草素通过抑制Wnt信号通路增强化疗药物对肿瘤细胞的敏感性［27-28］。在骨肉瘤研究中发现，化疗药物可诱发肿瘤细胞Wnt通路激活，抑制该通路可增加化疗对骨肉瘤细胞的敏感性［29］。β-catenin作为Wnt通路的核心蛋白，受上游分子GSK3β、AKT的调节，磷酸化GSK3β（p-GSK3β）及磷酸化AKT（p-AKT）作为其活化形式，可促进下游分子β-catenin激活，βcatenin入核后积累，作为转录因子调节下游靶基因，从而发挥其生物学作用［27］。本研究结果显示，与Control组比较，siRNA-GRP78组中AKT、GSK3β稍下降，p-AKT及p-GSK3β明显下降，且p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比例及β-catenin均明显下降，表明有效沉默GRP78后，Wnt通路相关蛋白受抑制；同理，与Control组比较，MPPα-PDT组中Wnt信号通路中p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β比例及βcatenin均增加，表明MPPα-PDT可诱导HOS骨肉瘤细胞中Wnt通路激活；同时，与MPPα-PDT组比较，siRNA-GRP78+MPPα-PDT组中Wnt通路相关蛋白表达均下降，表明有效沉默GRP78后，可抑制MPPα-PDT诱导HOS细胞Wnt通路的激活。

综上所述，骨肉瘤HOS细胞经过MPPα-PDT处理后，HOS细胞中GRP78表达增高；并且沉默GRP78表达后，骨肉瘤HOS细胞增殖活性下降、凋亡水平上调；同时，沉默GRP78表达可抑制MPPα-PDT诱导下的骨肉瘤Wnt通路激活，提示沉默GRP78增加骨肉瘤HOS细胞对MPPα-PDT的敏感性可能与抑制Wnt通路激活相关，这为沉默GRP78靶点联合MPPα-PDT治疗骨肉瘤提供了一定的实验依据。