五参顺脉胶囊通过自噬改善心肌缺血再灌注损伤

索红亮,孙治霞,曾垂义,张文宗,毛德西

(1.河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)心病科,郑州 450002;2.河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)重症医学科,郑州 450002;3.河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)名医堂,郑州 450002)

经皮冠状动脉(冠脉)支架术是治疗冠心病的有效手段,但近来研究发现,患者术后血心肌酶谱,如心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB,CKMB)等可出现显著升高,表明冠脉侵入性治疗可造成心肌损伤,即冠脉侵入性损伤,而心肌缺血再灌注模型可以模拟冠脉侵入性损伤情况[1-2],因此采用心肌缺血再灌注模型模拟冠脉侵入性损伤,深入探究其发生机理,对寻找有效途径以改善患者预后至关重要。五参顺脉胶囊(Wushen-Shunmai capsule)可显著改善心肌梗死及心绞痛等症状,本课题组前期大鼠实验研究证实,五参顺脉胶囊用于改善心肌缺血再灌注损伤的作用较明显,可能与内质网应激介导的细胞凋亡有关[3]。而磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路作为抗凋亡中经典通路之一,其下游分子-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)则为调节自噬的关键蛋白,研究显示,自噬性细胞死亡在缺血再灌注导致的心肌损伤中亦发挥重要作用[4-5]。因此,本研究拟通过心肌缺血再灌注损伤模型,基于PI3K/Akt介导的自噬信号通路,进一步深入探究五参顺脉胶囊对模型大鼠改善的作用机制,以期为其临床合理应用予以依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只雄性,6周龄SPF级SD大鼠,体重(200±20)g,购自斯莱克实验动物有限公司(上海)[SCXK(沪)2017-0005],在河南省中医院实验室饲养[SYXK(豫)2016-0009]。整个实验饲养条件为自由采食及饮水,12 h/12 h光照/黑暗条件下正常饲养,温度约25℃,相对湿度45%~65%。本研究的动物实验经河南省中医院动物伦理委员会批准(IACUC-20190417),并遵守审批内容实施,实验符合3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

五参顺脉胶囊购自河南省中医院,丢弃胶囊壳,药物取出后用羧甲基纤维素钠制成含生药100 g/L混悬液使用。抑制剂LY294002(货号:L9908)购自美国Sigma公司;大鼠cTnI ELISA试剂盒(货号:ab246529)、CK-MB ELISA试剂盒(货号:ab193696)、兔源一抗anti-微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)(货号:ab192890)、anti-PI3K(货号:ab32089)、antip-PI3K(货 号:ab182651)、anti-AKT(货 号:ab235958)、anti-p-AKT(货号:ab38449)、anti-mTOR(货号:ab109268)、anti-p-mTOR(货号:ab2732)、anti-天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartase-3,caspase3)(货号:ab13847)、anti-Bcl2相关X蛋白(Bcl2 associated X protein,Bax)(货号:ab32503)、anti-B 淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl2)(货 号:ab182858)、anti-β-actin(货号:ab8227),二抗羊抗兔IgG(货号:ab6721)均购自英国Abcam公司;FC型酶标仪、Themis透射电子显微镜均购自美国ThermoFisher公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备

参考文献[6]制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,SD大鼠术前腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,固定于手术台,腹部常规消毒后,打开胸腔,暴露心脏,于冠状动脉左前降支分支处穿入结扎线并套入一塑料管进行冠脉结扎,缺血30 min,心脏血液再灌流180 min,之后关闭胸腔、逐层缝合。

1.3.2 动物分组及给药

成模SD大鼠随机分为模型组、五参顺脉胶囊组、自噬抑制剂组(五参顺脉胶囊+LY294002组),每组15只,另取15只为假手术组(Sham组),处理方法与模型组相同,但不进行冠脉结扎。五参顺脉胶囊组灌胃0.9 g/kg五参顺脉胶囊[3],自噬抑制剂组于尾静脉注射LY2940020.3 mg/kg联合灌胃0.9 g/kg五参顺脉胶囊,假手术组与模型组均灌胃等量羧甲基纤维素钠溶剂,每天1次,连续2周。

1.3.3 血清cTnI、CK-MB蛋白浓度检测

给药结束后,尾静脉采血,离心后取上清。血清cTnI、CK-MB蛋白浓度以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测,具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 心肌梗死体积测定

各组5只大鼠处死,暴露心脏,取梗死区心肌组织以0.5 m厚度进行冰冻切片,置于预热的2%2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)溶液中,37℃孵育20 min至梗死区呈红色,弃去TTC溶液,添加4%多聚甲醛固定,拍照,以梗死区/危险区×100%记为梗死区比例(%)。

1.3.5 电镜观察心肌组织细胞自噬体形成数量

另取部分心肌组织,采用戊二醛-锇酸法双重固定,制备超薄切片,进行醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染,透射电镜下观察心肌细胞中自噬体结构及数量,每个样本计数最终自噬体形成数量为3个铜网孔(每孔约30000平方微米)内自噬体数量平均值。

1.3.6 心肌组织中LC3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、caspase3、Bax、Bcl2蛋白表达水平检测

提取心肌组织总蛋白并测定蛋白浓度,随后行SDS-PAGE电泳分离,转膜、室温封闭、一抗孵育,再分别添加anti-LC3(1∶2000)、anti-PI3K(1∶1000)、anti-p-PI3K(1∶1000)、anti-Akt(1∶1000)、anti-p-Akt(1∶1000)、anti-mTOR(1∶2000)、anti-p-mTOR(1∶1000)、caspase3(1∶1000)、Bax(1∶2000)、Bcl2(1∶1000)、anti-β-actin(1∶5000)4℃孵育过夜,二抗IgG(1∶5000)37℃孵育1 h,洗膜后显色、拍照并观察各蛋白条带灰度值。

1.3.7 心肌细胞凋亡检测

各组另取10只大鼠处死,固定部分心肌梗死组织,石蜡包埋后切片。原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色,各项步骤均具体操作严格按照TUNEL凋亡检测试剂盒附带说明书进行,最后进行DAB显色,苏木素复染、透明、封片。若呈棕褐色则为阳性凋亡细胞,呈蓝紫色为未凋亡细胞。每张切片于高倍镜下随机选取10个视野进行阳性细胞计数,凋亡指数(%)为阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.4 统计学方法

SPSS 25.0统计分析。所得结果用平均数±标准差(±s)表示,多组间比较单因素方差(one-way AVOVA)分析,两两间比较SNK-q分析,若P＜0.05则表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清心肌酶谱水平比较

与假手术组比,模型组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度增加(P＜0.05);与模型组比较,五参顺脉胶囊组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度降低(P＜0.05);与五参顺脉胶囊组比较,自噬抑制剂组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度增加(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度比较(±s,n=15)Table 1 Comparison of serum cTnI and CK-MB in rats of each group

表1 各组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度比较(±s,n=15)Table 1 Comparison of serum cTnI and CK-MB in rats of each group

注:与假手术组比较,*P＜0.05;与模型组比较,#P＜0.05;与五参顺脉胶囊组比较,&P＜0.05。Note.Compared with sham group,*P＜0.05.Compared with model group,#P＜0.05.Compared with Wushen-Shunmai capsule group,&P＜0.05.

组别Groups cTnI(ng/mL)CK-MB(U/L)假手术组Sham group 0.18±0.02716.84±142.39模型组Model group 0.76±0.08* 2069.75±196.58*五参顺脉胶囊组Wushen-Shunmai capsule group 0.51±0.04# 1132.46±163.32#自噬抑制剂组Autophagy inhibitor group 0.63±0.07& 1892.91±178.21&

2.2 各组大鼠心肌梗死区比例及自噬体数量比较

假手术组形态正常,未见线粒体肿胀;模型组线粒体肿胀明显、自噬泡数量增多;五参顺脉胶囊组出现部分线粒体肿胀现象、可观察到自噬泡;自噬抑制剂组与模型组类似。与假手术组比较,模型组大鼠心肌梗死区比例、自噬体数量增加(P＜0.05);与模型组比较,五参顺脉胶囊组大鼠心肌梗死区比例、自噬体数量降低(P＜0.05);与五参顺脉胶囊组比较,自噬抑制剂组大鼠心肌梗死区比例、自噬体数量增加(P＜0.05)。见图1、图2、表2。

表2 各组大鼠心肌梗死区比例及自噬体数量比较(±s)Table 2 Comparison of myocardial infarction area proportion and cardiomyocytes number of rats in each group

表2 各组大鼠心肌梗死区比例及自噬体数量比较(±s)Table 2 Comparison of myocardial infarction area proportion and cardiomyocytes number of rats in each group

注:与假手术组比较,*P＜0.05;与模型组比较,#P＜0.05;与五参顺脉胶囊组比较,&P＜0.05。Note.Compared with sham group,*P＜0.05.Compared with model group,#P＜0.05.Compared with Wushen-Shunmai capsule group,&P＜0.05.

组别Groups梗死区比例(%)(n=5)Proportion of infarct area自噬体数量(个)(n=10)Number of autophagosomes假手术组Sham group 0.13±0.027.14±1.42模型组Model group 39.75±2.86* 24.67±4.18*五参顺脉胶囊组Wushen-Shunmai capsule group 15.24±2.01# 12.36±2.25#自噬抑制剂组Autophagy inhibitor group 27.96±2.85& 18.86±3.47&

图1 各组大鼠心肌梗死区情况Note.A,Sham group.B,Model group.C,Wushen-Shunmai capsule group.D,Autophagy inhibitor group.Figure 1 Situation of myocardial infarction area in each group of rats

图2 各组大鼠心肌细胞自噬体情况Figure 2 Autophagosomes of rat cardiomyocytes in each group

2.3 各组大鼠心肌组织LC3蛋白表达水平比较

与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织LC3-II/LC3-I增加(P＜0.05);与模型组比较,五参顺脉胶囊组大鼠心肌组织LC3-II/LC3-I降低(P＜0.05);与五参顺脉胶囊组比较,自噬抑制剂组大鼠心肌组织LC3-II/LC3-I增加(P＜0.05)。见图3。

图3 各组大鼠心肌组织LC3蛋白表达水平比较Note.A,Sham group.B,Model group.C,Wushen-Shunmai capsule group.D,Autophagy inhibitor group.Compared with sham group, *P＜0.05. Compared with model group, #P＜0.05.Compared with Wushen-Shunmai capsule group,&P＜0.05.Figure 3 Comparison of LC3 protein expression in myocardium of rats in each group

2.4 各组大鼠心肌组织PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化蛋白表达水平比较

与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平降低(P＜0.05);与模型组比较,五参顺脉胶囊组大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平增加(P＜0.05);与五参顺脉胶囊组比较,自噬抑制剂组大鼠心肌组织p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平降低(P＜0.05)。见图4。

图4 各组大鼠心肌组织PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化蛋白表达Note.A,Sham group.B,Model group.C,Wushen-Shunmai capsule group.D,Autophagy inhibitor group.The same as below.Figure 4 Expression of PI3K,Akt,mTOR and their phosphorylated proteins in myocardium of rats in each group

2.5 各组大鼠心肌组织caspase3、Bax、Bcl2蛋白表达水平比较

与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织caspase3、Bax水平升高,Bcl2水平降低(P＜0.05);与模型组比较,五参顺脉胶囊组大鼠心肌组织caspase3、Bax水平降低,Bcl2水平升高(P＜0.05);与五参顺脉胶囊组比较,自噬抑制剂组大鼠心肌组织caspase3、Bax水平升高,Bcl2水平降低(P＜0.05)。见图5。

图5 各组大鼠心肌组织caspase3、Bax、Bcl2蛋白表达Figure 5 Expression of caspase3、Bax、Bcl2 proteins in myocardium of rats in each group

2.6 各组大鼠凋亡情况比较

与假手术组比较,模型组大鼠凋亡指数增加(P＜0.05);与模型组比较,五参顺脉胶囊组大鼠凋亡指数降低(P＜0.05);与五参顺脉胶囊组比较,自噬抑制剂组大鼠凋亡指数增加(P＜0.05)。见图6。

图6 各组大鼠心肌梗死区凋亡情况Figure 6 Apoptosis in myocardial infarction area of rats in each group

3 讨论

多项研究显示,冠脉介入手术亦存在风险,可损伤血管内皮,造成炎症的发生,甚至导致心肌缺血再灌注损伤[7-8]。本研究造模后显示,与假手术组比较,模型组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度、心肌梗死区比例均增加,心肌细胞受损时可导致心肌酶释放入血,血清cTnI、CK-MB浓度是反映心肌损伤的标志性酶[9],心肌梗死区比例则可直观评价心肌损伤,提示模型制备成功。五参顺脉胶囊最早由全国名老中医毛德西教授创立,该方以益气养阴为基础,兼有活血、理气、化湿、安神等功效,以原方或加减方治疗各证型冠心病效果显著[10],已有报道五参顺脉胶囊可强心、扩冠、抗凝、调整血脂和纠正心律失常等[11-12]。本研究结果亦发现,五参顺脉胶囊可降低心肌损伤大鼠血清cTnI、CK-MB浓度及心肌梗死区比例,提示五参顺脉胶囊对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有一定改善作用。

自噬是实现细胞及细胞器分解、代谢、再利用的一种维持细胞代谢平衡的生理现象,缺血/再灌注、缺氧/复氧等条件下,适度自噬可一定程度保护细胞免于坏死和凋亡,而随着疾病进展,细胞内会产生过度自噬,造成细胞内环境紊乱,引发自噬性死亡[13]。有研究报道,靶向调控自噬性死亡可能是治疗心肌缺血再灌注损伤的新策略,在心肌缺血再灌注中存在过度自噬现象,减轻自噬作用可缓解疾病[14-15]。本研究结果发现,与假手术组比较,模型组大鼠心肌梗死区自噬体数量增加,自噬标志性蛋白LC3-II/LC3-I亦增加,心肌细胞达到过度自噬水平,从而加重疾病进程。而五参顺脉胶囊可减少心肌梗死区自噬水平,降低LC3-II/LC3-I,提示五参顺脉胶囊通过减轻自噬对心肌缺血再灌注损伤大鼠起保护作用。

调控自噬的信号通路很多,其中以PI3K/Akt/mTOR通路研究最为广泛,PI3K/Akt是一种经典抗凋亡通路,该通路激活可导致Akt活化,Akt磷酸化水平与该通路活化程度密切相关。mTOR对吞噬泡形成及成熟起抑制作用,是调控自噬的关键蛋白,抑制mTOR表达后可直接抑制自噬[16-17]。多项研究表明,PI3K/Akt/mTOR通路介导的自噬与缺血再灌注引起的心肌损伤严重程度密切相关,激活该通路可抑制过度自噬、减轻心肌细胞损伤[18-20]。本研究结果发现,与模型组比较,五参顺脉胶囊可增加心 肌 组 织 p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平,提示五参顺脉胶囊亦可能通过PI3K/Akt/mTOR通路对侵入性损伤大鼠发挥保护作用。为了进一步验证五参顺脉胶囊是否通过PI3K/Akt介导的自噬通路发挥保护作用,本研究采用自噬抑制剂LY294002与五参顺脉胶囊共同给药,结果发现,与五参顺脉胶囊组比较,自噬抑制剂组大鼠血清cTnI、CK-MB浓度、心肌梗死区比例、凋亡指数、凋亡蛋白caspase3、Bax、自噬体数量及LC3-II/LC3-I均增加,抗凋亡蛋白Bcl2水平降低,提示五参顺脉胶囊抑制心肌细胞过度自噬,发挥抗心肌梗死、心肌细胞凋亡作用,从而改善缺血再灌注损伤。

综上所述,五参顺脉胶囊抑制心肌细胞过度自噬,对心肌缺血再灌注损伤大鼠发挥保护作用。本研究进一步丰富与完善了五参顺脉胶囊减轻心肌缺血再灌注损伤的作用机制,对其临床应用具有进一步参考价值。