柴芍六君汤对肝郁脾虚型慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜细胞增殖和凋亡因子的影响

朱景茹,洪银洁,黄婉仪,张 斐,涂文玲,杨宗保,甘慧娟*

(1.福建中医药大学中医证基地,福州 350122;2.福建中医药大学针灸学院,福州 350122;3.厦门大学中医系,福建 厦门 361102)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是临床常见的胃癌前期疾病,可见胃黏膜组织病理萎缩、变薄,是“炎癌转化”的关键环节[1]。大量临床研究证实,柴芍六君汤对CAG患者有显著疗效,可以确切改善胃脘部不适症状,逆转病理萎缩,促进疾病向愈[2-4]。然而,柴芍六君汤防治CAG的整体调节机制尚未得到充分揭示,因此,有必要从分子生物学角度深入研究柴芍六君汤对肝郁脾虚型CAG大鼠胃黏膜细胞增殖、凋亡的影响,为中药防治CAG、阻断其向胃癌进展的临床应用提供科学实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠,8周龄,26只,雌雄各半,体重(200±20)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK(沪)2019-0005]。大鼠群养于垫玉米芯的饲料笼中,垫料4 d更换1次,雌雄分笼饲养,控制室温21℃~23℃,相对湿度50%,自由摄食饮水,在厦门大学动物实验中心[SYXK(闽)2018-0009]适应性喂养7 d后进行分组实验。本实验经厦门大学实验动物管理伦理委员会批准(XMULAC20190142),实验过程严格遵循3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

脱氧胆酸钠(批号:20190901,北京奥博星生物技术);25%~28%氨水(批号:C10586777,上海百舜生物科技);维酶素片(批号:20190405,乐普恒久远药业);HE染色试剂盒(批号:J19S11Y125305,上海源叶生物科技);逆转录试剂盒(批号:AJ52623A,日本TaKaRa公司);PCNA抗体(货号:24036,美国Proteintech公司);Ag-NOR染色液(货号:G2015,北京索莱宝科技);TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(货号:C1088,上海碧云天生物技术);基因扩增仪、荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司);正置荧光显微镜(德国Carl Zeiss公司);半自动切片机(德国Leica公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 药物制备

维酶素混悬液:给药前用蒸馏水配制混悬液,按照大鼠是人常规剂量的6倍计算[5],给药量为240 mg/(kg·d)。柴芍六君汤出自《医宗金鉴》,组方:北柴胡6 g,人参9 g,白芍4.5 g,白术9 g,茯苓9 g,法半夏4.5 g,制陈皮6 g,炙甘草3 g,饮片由闽侯上街致诚医药商店提供,经鉴定为质量合格的中药饮片。常规煎煮2次后混匀,浓缩成含生药量0.51 g/mL中药汤剂,无菌纱布过滤后分装入瓶,4℃冰箱储存。

1.3.2 分组、造模与处理

26只大鼠根据Excel随机生成数字分为2组,即正常组6只和造模组20只。正常组不予处理,造模组采用复合因素造模法[6-7]建立肝郁脾虚型CAG大鼠模型:大鼠予每日现配的20 mmol/L脱氧胆酸钠溶液和0.1%氨水溶液交替自由饮用,配合2 d足食、1 d禁食的饥饱失常法,每日夹尾激惹1 h,造模10周。造模组每5周随机抽取1只大鼠进行造模评价,取材胃黏膜组织观察形态色泽、皱壁厚薄及病理形态,结合大便性状、毛发色泽、精神状况及强迫游泳实验等结果综合判断。将成模大鼠随机分为3组,即模型组、维酶素组和柴芍六君汤组,每组6只。柴芍六君汤组予柴芍六君汤5.1 g/(kg·d),维酶素组予维酶素混悬液240 mg/(kg·d),正常组和模型组予灭菌饮用水,按体重10 mL/kg灌胃,干预4周后取材。修剪胃黏膜组织周边多余脂肪,生理盐水漂洗后观察胃黏膜形态色泽、皱壁厚薄,取胃窦部固定于4%多聚甲醛溶液中24 h,胃体部冻存-80℃冰箱备用。

1.3.3 胃黏膜组织形态学观察

胃黏膜组织经流水冲洗6 h后,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋后切片,切片厚度约4μm,63℃烘片机烤片4 h,脱蜡后行HE染色,显微镜观察胃黏膜组织病理结构变化。

1.3.4 qPCR法检测胃黏膜凋亡基因c-myc和p53 mRNA水平

引物序列5’-3’:c-myc:F-TCTCCGTCCTATG TTGCG,R-GGCTGGTGCTGTCTTTGC;p53:F-GCGTT GCTCGATGGTGA,R-CAGCGTGATGATGGTAAGG;βactin:F-CTGGCTCCTAGCACCATGAA,R-AAAACGC AGCTCAGTAACAGTC。引物由上海百赛生物技术有限公司设计合成。TRIzol法提取胃黏膜组织总RNA并进行浓度测试,逆转录成cDNA后按照说明书配制反应体系,放入荧光定量PCR仪进行qPCR反应,记录各组CT值,采用2-△△Ct计算方法进行统计分析。

1.3.5 IHC法检测PCNA和Ag-NOR含量

胃黏膜组织切片、脱蜡、水化后进行热抗原修复,10%山羊血清室温封闭1 h,一抗37℃孵育1 h,PBS漂洗4次,加入二抗37℃孵育1 h,PBS漂洗10次,DAB显色,苏木素复染后流水冲洗30 min,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片后显微镜观察。运用软件Image J v1.8.0进行平均光密度(IOD/area)分析。

1.3.6 TUNEL法检测胃黏膜细胞凋亡指数

胃黏膜组织脱蜡,蛋白酶K消化,按照说明书配制TUNEL试剂,加检测液37℃避光孵育1 h,PBS漂洗3次,用抗荧光淬灭的封片液封片,绿色荧光发射波长为515~565 nm,显微镜下计数阳性细胞个数。

1.4 统计学方法

运用软件SPSS 23.0进行统计分析,计量资料属正态分布用平均数±标准差(±s)表示,反之则用M(P25,P75)表示。多组比较符合正态分布采用单因素方差分析,组间比较不符合正态分布用秩和检验。按α=0.05检验水准,以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 模型评价

正常组大鼠活泼喜动,好奇心强,毛发洁白光泽,大便色褐且无明显臭味;胃黏膜组织形态正常,上皮细胞完整无缺损,固有腺体整齐规则。造模组大鼠毛发淡黄质硬,神态疲倦,大便味臭,溏结不调;胃黏膜组织固有腺体萎缩,炎性细胞浸润,主细胞和壁细胞减少;强迫游泳静止时间较正常组明显延长(P＜0.01)。见表1。

表1 两组大鼠强迫游泳静止时间比较M(P25,P75)Table 1 Comparison of static time in forced swimming of rats in two groups M(P25,P75)

2.2 大鼠一般情况比较

正常组大鼠毛发洁白光泽,活跃好奇,精力充沛,灌胃抵抗较明显;模型组大鼠毛发蓬松无光泽,色淡黄质硬,神态仍稍疲惫,偶见安静扎堆,反应较迟钝,灌胃时温顺不抵抗;维酶素组大鼠毛发蓬松,少有光泽,活泼警惕,灌胃偶有抵抗;柴芍六君汤组大鼠毛发淡黄质硬,稍有光泽,活泼好动,灌胃抵抗。

2.3 大鼠胃黏膜组织形态学比较

正常组大鼠胃黏膜组织颜色鲜红,色泽光亮,黏膜皱襞丰富充盈,形态正常;光镜下可见组织结构完整,细胞排列紧密整齐,未见细胞坏死。模型组大鼠胃黏膜组织颜色稍灰暗,厚度变薄,色泽较差,皱襞减少甚至消失;固有腺体萎缩,炎性细胞浸润,部分细胞脱落、坏死,排列紊乱。维酶素组大鼠胃黏膜组织色泽鲜红,胃黏膜厚度较模型组增厚,黏膜皱襞增加;胃黏膜形态较模型组改善,炎性细胞浸润减轻,腺腔仍较大,细胞排列较整齐。柴芍六君汤组大鼠胃黏膜形态趋向于正常组,胃黏膜未见充血水肿,黏膜皱襞明显增多,厚度较厚;固有腺体萎缩改善,黏膜层连续完整,腺腔体积小,少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 大鼠胃黏膜组织直观图与组织病理图(HE染色)Figure 1 Visual and histopathological images of gastric mucosa in rats(HE staining)

2.4 大鼠胃黏膜凋亡基因c-myc和p53比较

与正常组比,模型组大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表达均显著上升(P＜0.01);维酶素组和柴芍六君汤组大鼠胃黏膜p53 mRNA表达上升(P＜0.05或P＜0.01),c-myc mRNA表达较正常组均有上升趋势,差异无统计学意义(P＞0.05)。与模型组比,维酶素组和柴芍六君汤组大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表达均下降(P＜0.05或P＜0.01)。与维酶素组比,柴芍六君汤组大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表达均有上升趋势,差异无统计学意义(P＞0.05)。这说明柴芍六君汤和维酶素均能抑制肝郁脾虚型CAG大鼠胃黏膜细胞过度凋亡且作用基本一致。见表2,图2。

表2 大鼠胃黏膜细胞凋亡基因c-myc和p53比较(±s,n=6)Table 2 Comparison of apoptosis genes c-myc and p53 in gastric mucosa of rats

表2 大鼠胃黏膜细胞凋亡基因c-myc和p53比较(±s,n=6)Table 2 Comparison of apoptosis genes c-myc and p53 in gastric mucosa of rats

注:与 正 常 组 比 较,a P＜0.05,b P＜0.01;与 模 型 组 比 较,c P＜0.05,d P＜0.01。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.

组别Groups c-myc p53正常组Normal group 1.06±0.361.06±0.38模型组CAG group 11.42±3.21b 17.26±6.28b维酶素组VI group 3.44±1.62d 5.80±1.85bc柴芍六君汤组CS group 4.08±2.58d 7.43±2.85ac

图2 大鼠胃黏膜细胞凋亡基因c-myc及p53电泳图Figure 2 Electrophoretogram of apoptosis genes c-myc and p53 in rat gastric mucosa

2.5 大鼠胃黏膜增殖因子PCNA和Ag-NOR比较

与正常组比,模型组大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表达均上升(P＜0.05或P＜0.01),维酶素组大鼠胃黏膜PCNA蛋白表达显著上升(P＜0.01),柴芍六君汤组大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表达均有上升趋势,差异无统计学意义(P＞0.05)。与模型组比,柴芍六君汤组大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表达均上升(P＜0.05或P＜0.01),维酶素组大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表达较模型组有下降趋势,差异无统计学意义(P＞0.05)。与维酶素组比,柴芍六君汤组大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR表达均有下降趋势,差异无统计学意义(P＞0.05)。这提示柴芍六君汤在抑制肝郁脾虚型CAG大鼠胃黏膜细胞过度增殖方面的效果要优于维酶素。见表3,图3。

图3 大鼠胃黏膜PCNA和Ag-NOR表达量Note.PCNA, Proliferating cell nuclear antigen.Ag-NOR,Argyrophilic nucleolar organizer region protein.Compared with the normal group, a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.Figure 3 Expression of PCNA and Ag-NOR in gastric mucosa of rats

表3 大鼠胃黏膜细胞增殖因子PCNA和Ag-NOR表达量比较(±s,n=6)Table 3 Comparison of PCNA and Ag-NOR expression in gastric mucosa of rats

表3 大鼠胃黏膜细胞增殖因子PCNA和Ag-NOR表达量比较(±s,n=6)Table 3 Comparison of PCNA and Ag-NOR expression in gastric mucosa of rats

注:与正常组比较,a P＜0.05,b P＜0.01;与模型组比较,c P＜0.05,d P＜0.01。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.

组别Groups PCNA Ag-NOR正常组Normal group 0.58±0.100.46±0.14模型组CAG group 0.83±0.12b 0.64±0.16a维酶素组VI group 0.73±0.14b 0.54±0.12柴芍六君汤组CS group 0.61±0.77d 0.47±0.77c

2.6 大鼠胃黏膜凋亡指数比较

与正常组比,模型组大鼠胃黏膜凋亡指数上升(P＜0.05)。与模型组比,柴芍六君汤组大鼠胃黏膜凋亡指数下降(P＜0.05),维酶素组大鼠胃黏膜凋亡指数较模型组有下降趋势,差异无统计学意义(P＞0.05)。与维酶素组比,柴芍六君汤组大鼠胃黏膜凋亡指数有下降趋势,差异无统计学意义(P＞0.05)。这表明柴芍六君汤对肝郁脾虚型CAG大鼠胃黏膜细胞过度凋亡具有抑制作用。见表4,图4。

表4 大鼠胃黏膜凋亡指数比较(±s,n=6)Table 4 Comparison of gastric mucosal apoptosis index in rats

表4 大鼠胃黏膜凋亡指数比较(±s,n=6)Table 4 Comparison of gastric mucosal apoptosis index in rats

注:与正常组比较,a P＜0.05;与模型组比较,b P＜0.05。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05.Compared with the CAG group,b P＜0.05.

组别Groups凋亡指数(%)Apoptosis index正常组Normal group 0.19±0.07模型组CAG group 0.64±0.21a维酶素组VI group 0.39±0.16柴芍六君汤组CS group 0.19±0.51b

图4 大鼠胃黏膜凋亡情况Figure 4 Apoptosis of gastric mucosa in rats

3 讨论

胃癌发病率和死亡率均居我国恶性肿瘤第3位,严重威胁人类生命健康,CAG是由于多种致病因素关联作用于机体后出现胃黏膜侵袭与防御因素失衡的胃黏膜损伤性疾病,与胃癌的发病率呈正相关[8-10],因此,对CAG采取早期干预措施,防止甚至逆转肠化生与上皮内瘤变的发生,是阻断胃癌进展的重要手段。中医认为脾胃虚弱是CAG的发病基础,气滞亦为本病核心,课题组前期研究表明,肝郁脾虚是CAG重要病理特点,二者常相互影响导致CAG的发病,又因气滞不行或脾虚不运,妨碍津液正常运行,以致痰聚湿阻,日久易致癌变[11]。肝郁脾虚型病证结合动物模型一直是中医药基础研究的热点和特色理论,有学者从宏观表征、行为学以及理化指标方面进行模型评价[12]。本实验造模结束后,造模组大鼠病理可见胃黏膜固有腺体萎缩,明显炎性细胞浸润;一般行为观察出现毛发色黄质硬,神态疲倦,大便溏结不调,安静扎堆,行为抑郁,强迫游泳静止时间明显延长,上述表现较符合肝郁脾虚型CAG的生物学特征,提示模型成功建立。柴芍六君汤是临床治疗肝郁脾虚型CAG的经典方剂,具有疏肝健脾化痰的作用,经本方治疗后,模型大鼠可见精神状态好转,活动度增加,胃黏膜皱襞明显增多、固有腺体萎缩改善、少量炎性细胞浸润。本实验结果提示,柴芍六君汤能够明显改善肝郁脾虚型CAG大鼠的精神及活动状态,促进胃黏膜组织损伤修复。

CAG发生发展过程中涉及胃黏膜细胞信号转导紊乱和多基因表达异常,细胞增殖、凋亡失衡是CAG发生的关键因素之一,有研究指出,促凋亡基因c-myc和p53等异常表达均可能参与癌变的某个环节[13-14]。c-myc作为原癌基因磷酸化蛋白质,能够直接控制DNA的合成,在细胞凋亡、分化、黏附以及细胞周期调控中发挥重要作用,可以维持胃癌细胞的恶性表型,在CAG甚至胃癌中存在过表达情况[15]。p53是肿瘤抑制基因,能够监护细胞基因的完整性,其蛋白活化水平的增加可降低细胞发生凋亡反应的阈值,癌组织分化越差,p53异常表达的分布就越广泛[16]。本实验结果显示,模型组大鼠存在胃黏膜细胞过度凋亡的表现,凋亡基因c-myc、p53以及凋亡指数表达均升高,经药物干预后,柴芍六君汤组大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表达和凋亡指数均下降,维酶素组大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表达下降,凋亡指数有下降趋势但无统计学差异,提示柴芍六君汤和维酶素都能够有效抑制CAG大鼠胃黏膜细胞的过度凋亡,下调胃黏膜c-myc、p53 mRNA表达水平,从而起到治疗肝郁脾虚型CAG的作用。

PCNA主要参与细胞DNA复制、修复及细胞周期调控等多个重要环节,其含量反映出细胞的生长速度及状态,对胃癌癌前病变的诊断、分级、指导治疗、预后转归具有实用性价值,是具有代表性的细胞增殖标记物[17]。Ag-NOR含量取决于转录活动的水平和染色体组中携带NOR染色体的数量,细胞增殖活跃导致Ag-NOR大量增加,细胞中Ag-NOR的含量对胃黏膜变异程度研究有着重要意义[18]。IHC检测结果证实,模型组大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白存在高表达,经药物干预后,柴芍六君汤组大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表达水平均出现不同程度的下降,维酶素组大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表达有下降趋势但无统计学差异,表明柴芍六君汤能够对肝郁脾虚型CAG大鼠胃黏膜细胞的过度增殖起抑制作用,且相较于阳性药物维酶素具有更大的治疗优势。

综上所述,柴芍六君汤对肝郁脾虚型CAG大鼠精神状态和病理形态具有明显改善作用,且能够下调胃黏膜c-myc、p53 mRNA和PCNA、Ag-NOR蛋白表达水平,抑制胃黏膜细胞过度增殖、凋亡。因此认为,柴芍六君汤对肝郁脾虚型CAG大鼠的整体治疗作用可能与调控胃黏膜细胞过度增殖、凋亡,从而使其增殖、凋亡水平趋向于平衡状态有关。此外,是否还涉及其他更多增殖凋亡基因参与或者信号转导通路的影响,还需要进一步验证。