高温和酶解处理水稻秸秆后植物促生物质的鉴定及其效果研究

唐思宇，刘秋梅，孟晓慧，马磊，刘东阳，黄启为，沈其荣

高温和酶解处理水稻秸秆后植物促生物质的鉴定及其效果研究

唐思宇，刘秋梅，孟晓慧，马磊，刘东阳，黄启为，沈其荣

南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心，南京 210095

【】探究农业废弃物水稻秸秆对植物的促进作用，质谱鉴定并比较分析水稻秸秆高温浸提液以及酶解液中可能存在的小分子促生物质，验证这些物质对黄瓜生长的促进效果。通过高温水浸提的方式，在温度115℃，浸提时间30 min的条件下制备水稻秸秆高温浸提液；通过硫酸铵沉淀法浓缩哈茨木霉菌NJAU 4742在以水稻秸秆为唯一碳源下液体发酵产生的胞外酶，并利用该胞外酶降解水稻秸秆，从而制备水稻秸秆酶解液，将水稻秸秆高温浸提液及酶解液稀释成不同倍数后，通过黄瓜水培试验验证其促生效果，基于UHPLC-QE-MS非靶标检测技术对其中的促生物质进行质谱分析，QE质谱仪在采集软件（Xcalibur 4.0.27，Thermo）的控制下，以信息相关采集模式对水稻秸秆高温浸提液以及酶解液进行一级、二级质谱数据采集，通过自主编写的R程序包（内核为XCMS）对原始数据进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB（V2.1）自建二级质谱数据库匹配进行物质注释。最后通过黄瓜水培试验验证部分二级质谱鉴定物质的促生效果。水稻秸秆高温浸提液和酶解液在适宜浓度下均能促进黄瓜幼苗生长，其中水稻秸秆酶解液在稀释100倍时对黄瓜有明显促生效果，与CK相比，经过酶解液处理的植株地上部干重、地下部干重和株高分别增加了52.64%、55.05%和21.43%，植株根尖数增加了31.95%；水稻秸秆高温浸提液在稀释50倍时促生效果最好，与CK相比，高温浸提液处理后的植株地上部干重、地下部干重和株高分别增加了44.16%、63.38%和55.56%，植株根尖数增加了64.44%。UHPLC-QE-MS非靶标检测技术结果表明，在水稻秸秆高温浸提液中鉴定出714种物质，在酶解液中鉴定出638种物质；基于二级质谱结果进一步分析发现，乙酰胆碱、左旋肉碱和肌醇可能是促生相关的功能物质；外源添加3种功能物质化学标准品的研究结果表明，3种物质均对黄瓜幼苗生长有显著的促进效果。1、10、100 μmol·L-1浓度的乙酰胆碱均能促进黄瓜植株的生长，与CK 相比，1 μmol·L-1浓度的外源乙酰胆碱使黄瓜地上部干重增加54.69%，根系干重增加了73.67%，黄瓜根尖数增加了130.5%；外源左旋肉碱在0.1和1 mmol·L-1浓度下有利于黄瓜植株生长，与CK相比，黄瓜地上部干重分别增加了33.79%和30.19%，根系干重分别增加了44.97%和48.82%，黄瓜根尖数分别增加了41.8%和49.9%；在黄瓜水培体系中添加0.05、0.1 mmol·L-1浓度的外源肌醇可以促进其生长，与CK相比，黄瓜地上部干重分别增加了36.66%和30.15%，根系干重增加了69.82%和51.78%，黄瓜根尖数分别增加了149.0%和96.7%。水稻秸秆高温浸提液和酶解液均能显著促进黄瓜生长，LCMS分析结果及化学标准品添加试验表明高温浸提液和酶解液中乙酰胆碱、左旋肉碱和肌醇等小分子是关键性的功能物质，对黄瓜具有显著的促生效应。

水稻秸秆；高温浸提；酶解；液质联用；促生

0 引言

【研究意义】我国对农产品的需求不断增加，寻找提高作物生产力的新方法势在必行。我国是世界上最大的谷物生产国和消耗国，水稻秸秆是主要的农业固体废弃物之一，如何提高水稻秸秆的再利用效率是当前研究重点[1]。研究表明，秸秆还田可提高土壤有机质含量和提升土壤肥力，进而增加作物产量，对保持农田生态平衡有重要意义[2-3]。但由于秸秆结构中有大量难降解的木质素和纤维素，传统的秸秆还田技术在实际应用过程中往往会产生各种问题[4]。木霉菌是一种广泛存在于土壤、植物根际和叶面的腐生型真菌，是土壤微生物的重要群落之一[5-6]。作为一种有益真菌，研究发现木霉具有很强的分解纤维素能力[7]；木霉菌利用农业废弃物秸秆作为发酵载体，在发酵过程中，秸秆中的有机废物被微生物充分利用，进而产生更多有利于植物生长的营养物质，且对环境无危害[8-9]。本研究旨在寻找解决由水稻秸秆带来的环境问题的新方法，通过高温浸提及木霉酶解的方式从水稻秸秆中提取对植物生长具有促进作用的成分，以稻草为原料生产植物生长促进剂，为农业废弃物的利用提供新的途径，对减少农业生产中化学肥料的用量、提高秸秆高效低成本降解技术和改善生态环境具有重要意义。【前人研究进展】与化肥相比，植物产生的生物效应剂为作物生长和土壤健康提供了一种更环保的方式[10]，其中腐殖质（humic substances，HS）被广泛认为是一种植物生长促进剂，主要由于它能够增大植物根系及其分枝，或者使其有更大密度的根毛以及根表面积[11-12]。另外，水稻秸秆衍生的HS在腐烂期间显著增加，导致土壤有机物溶解力增强[13]。研究表明与使用其他溶剂相比，用水提取秸秆中的HS具有更好的促生效果，水提物不会对植物产生化学毒性、能提高种子发芽率和促进根的伸长[14]。水稻秸秆中的生物活性物质对番茄幼苗生长有促进作用，研究证实水稻秸秆中的HS主要由多酚类物质和多糖组成[15]。【本研究切入点】本试验发现对水稻秸秆进行高温浸提后，其上清液对黄瓜生长有促进作用，基于此现象，为寻求更节能高效的秸秆利用方式，利用哈茨木霉菌NJAU 4742对木质纤维素的降解能力来释放水稻秸秆中的小分子物质，验证水稻秸秆酶解产物对黄瓜的促生作用；利用UHPLC-QE-MS非靶标检测技术对水稻秸秆高温浸提液以及酶解产物进行物质鉴定和比较分析，并筛选出其中主要的促生长物质，并通过黄瓜水培试验对这些功能物质进行了外源添加验证分析。【拟解决的关键问题】探究水稻秸秆高温浸提液以及酶解液对黄瓜生长的促进作用及其最适施用浓度，鉴定并分析水稻秸秆经过高温浸提或酶解后释放的小分子物质，筛选水稻秸秆中的促生物质并进行黄瓜水培验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 哈茨木霉菌NJAU 4742，由南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化利用重点实验室提供。

1.1.2 供试植物 津春4号黄瓜，天津市黄瓜研究所提供。

1.1.3 供试秸秆 所使用的秸秆为南粳2728水稻秸秆。

1.1.4 培养基 无机盐培养基：硫酸铵5 g·L-1、磷酸二氢钾15 g·L-1、硫酸镁0.6 g·L-1、无水葡萄糖10 g·L-1、无水氯化钙1 g·L-1、一水合硫酸锰1.6 mg·L-1、七水合硫酸亚铁5 mg·L-1、七水合硫酸锌1.4 mg·L-1、氯化钴2 mg·L-1。

MS培养基（不含琼脂、蔗糖和有机质）：硝酸钾1.90 g·L-1、硝酸铵1.65 g·L-1、磷酸二氢钾0.17 g·L-1、硫酸镁0.37 g·L-1、氯化钙0.44 g·L-1、碘化钾0.83 mg·L-1、硼酸6.2 mg·L-1、硫酸锰22.3 mg·L-1、硫酸锌8.6 mg·L-1、钼酸钠0.25 mg·L-1、硫酸铜0.025 mg·L-1、氯化钴0.025 mg·L-1、乙二胺四乙酸二钠37.3 mg·L-1、硫酸亚铁27.8 mg·L-1。

1.2 方法

1.2.1 水稻秸秆预处理 为了去除水稻秸秆中的杂质并提高水稻秸秆中有机物的释放，将水稻秸秆剪碎后用自来水多次冲洗，在55℃烘箱下干燥后研磨成粉末，过60目筛后在干燥处保存备用。

1.2.2 水稻秸秆高温浸提液的制备 取研磨并过60目筛的水稻秸秆粉末和去离子水混匀，保证秸秆含量为1%（w/v），在115℃下浸提30 min，待冷却后离心弃沉淀，并用0.22 μm滤膜过滤上清液，滤液定义为水稻秸秆高温浸提液，于4℃冰箱保存备用。

1.2.3 哈茨木霉菌NJAU 4742液体发酵 选用1%（w/v）葡萄糖为碳源的基础无机盐培养基作为液体发酵培养液，接入哈茨木霉菌NJAU 4742新鲜孢子液1 mL（孢子浓度为107spore·mL-1）后，在28℃、170 r/min条件下培养2 d；将培养好的木霉菌体用2层无菌纱布过滤，再用ddH2O冲洗3—4次，转接到200 mL以1%（w/v）水稻秸秆粉末为唯一碳源的基础无机盐培养基中，在28℃、170 r/min条件下培养5 d。培养结束后，将发酵产物离心进行固液分离，上清液过无菌滤膜，保存至4℃冰箱。

1.2.4 硫酸铵沉淀 在冰浴条件下，向1 L发酵粗酶液中加入516 g固体硫酸铵粉末（75%饱和度）。待硫酸铵粉末完全溶解后，将混合液置于4℃冰箱静置过夜，使蛋白质充分沉淀。沉淀结束后，将混合物在4℃、12 000 r/min条件下离心10 min，弃上清液保留沉淀。沉淀用1—2倍沉淀物体积的PBS缓冲液重悬，将重悬后的粗酶液放入透析袋中透析12 h，每隔3 h更换一次透析液。收集透析后的粗酶液，用考马斯亮蓝染色法测定上清中蛋白质的含量，并分装保存在-80℃冰箱备用。

1.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳 分别制备5%的浓缩胶和10%的分离胶，待凝固后取15 μL液体发酵上清液以及浓缩的粗酶液和2 μL 10×Loading Buffer（含5%巯基乙醇和8 mol·L-1尿素）混合均匀后上样6 μL，并在电压为80 V，电流200 mA条件下电泳2—3 h。电泳结束后，将蛋白胶从玻璃板中取出，用去离子水清洗一遍后，放入固定液中进行固定30 min；固定完成后取出蛋白胶冲洗，致敏30 min后水洗3次，每次10 min，银染25 min，再水洗3次，每次1 min，最后放入显色液中进行显色，待蛋白条带显色完全后，将蛋白胶放入终止液中终止显色，并进行扫描拍照。

1.2.6 水稻秸秆酶解液的制备 将1 g过60目筛的水稻秸秆粉末加100 mL去离子水，在115℃下，高压灭菌30 min，4 000×离心10 min后弃上清，加入无菌水超声波清洗5 min后弃上清，反复超声清洗5次。将水洗后的水稻秸秆粉末转入250 mL三角瓶并加无菌水80 mL，再加入20 mL 50 mmol·L-1的pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液和0.5 mL浓缩粗酶液，同时设置加入灭活的粗酶液作为对照。体系在37℃，200 r/min条件下振荡酶解3 d，酶解完成后将酶解产物10 000×离心10 min保留上清液，并置于4℃冰箱保存备用。

1.2.7 水稻秸秆高温浸提产物及酶解产物的鉴定分析

1.2.7.1 水稻秸秆高温浸提液及酶解液冷冻干燥 收集秸秆高温浸提液和酶解液后，将样品过0.22 μm无菌滤膜，装入冷冻干燥瓶中，在-80℃冰箱中冷冻完全后，转入冷冻干燥机的冻干箱中，设置预冻温度后，启动仪器直至样品完全脱水冻干成粉末。

1.2.7.2 促生物质提取 在20 mg粉末样品中加入

1 000 μL提取液（甲醇﹕乙腈﹕水=2﹕2﹕1（v/v）），涡旋混匀30 s；利用球磨仪在35 Hz条件下研磨处理4 min，在冰上超声5 min；重复研磨超声步骤3次；-40℃条件下静置1 h；将样品4℃，12 000 r/min离心15 min；取上清置于进样瓶中备用。

1.2.7.3 上机检测 本研究使利用UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters）1290 Infinity系列UHPLC系统（Agilent Technologies）对目标化合物进行色谱分离。流动相由25 mmol·L-1乙酸铵和25 mmol·L-1氨水（pH 9.75）的溶液（A）和乙腈（B）组成；在0—0.5 min，95% B; 0.5—7.0 min，95%—65%B；7.0—8.0 min，65%—40%B；8.0—9.0 min，40%B；9.0—9.1 min，40%—95%B；9.1—12.0 min，95%B条件下进行梯度洗脱；流动相流速设置为0.5 mL·min-1，柱温设置为25℃，自动进样器温度设置为4℃，进样量为3 μL。

QE质谱仪在采集软件（Xcalibur 4.0.27，Thermo）的控制下，以信息相关采集（IDA）模式进行一级、二级质谱数据采集，在此模式下，采集软件会连续评估全扫描质谱图。设定ESI源条件为：鞘气流速为45 Arb，辅助气流速为15 Arb，毛细管温度400℃，全MS分辨率为70 000，MS/MS分辨率为17 500，碰撞能量为10/30/60，在NCE模式下，喷涂电压分别为4.0 kV（正）或-3.6 kV（负）。

1.2.7.4 数据处理 用ProteoWizard软件将原始数据转成mzXML格式后，使用自主编写的R程序包（内核为XCMS）进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与BiotreeDB（V2.1）自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。

1.2.8 黄瓜无菌苗培养 将黄瓜种子用50℃温水浸泡10 min，再转移至30℃水中浸泡3 h后，在超净台用70%无水乙醇溶液消毒3 min，再用含2%有效氯的次氯酸钠溶液消毒3 min，用无菌水漂洗6次，洗去种子表面残留的次氯酸钠溶液，再将黄瓜种子均匀铺在镂空的网格上，网格架空于2 L的玻璃烧杯中，网格下加入灭菌过的1/4MS培养基，使培养基液面稍微低于网格，用8层纱布和皮筋封牢烧杯口（发苗装置用纱布包好后提前进行115℃，30 min灭菌处理）。将玻璃烧杯置于30℃黑暗的恒温培养箱中催芽2 d，当种子长出芽白后将烧杯移至28℃温室中继续培养（16 h光照/8 h黑暗）。当幼苗长出两片子叶并生长至6 cm高度时，在无菌环境下用镊子小心将黄瓜幼苗从烧杯中移出，转接至50 mL三角瓶中，加入50 mL灭菌处理的1/4 MS培养液，用无菌棉花固定黄瓜苗，待黄瓜苗长至一叶一心时做后续试验处理。

1.2.9 黄瓜水培试验 黄瓜水培试验于2020年4—7月在南京农业大学资源与环境科学学院温室进行，当黄瓜无菌苗培育至一叶一心时，将长势一致的黄瓜幼苗从50 mL三角瓶转移至100 mL三角瓶中，并进行处理。

水稻秸秆高温浸提液/酶解液的黄瓜水培试验设计：一共设置了4种不同的稀释倍数，分别为将水稻秸秆高温浸提液/酶解液稀释25倍、50倍、100倍和200倍（分别标注为25、50、100、200），设置只添加1/4MS营养液的处理作为空白对照（CK），每个处理设置6个生物学重复。每隔3 d更换营养液一次，更换时按照处理浓度补充高温浸提液或酶解液，培育期间定期观察记录黄瓜植株的生长状态，培养11 d后收苗并测量植株生长指标。

外源添加氯化乙酰胆碱、左旋肉碱和肌醇的黄瓜水培试验设计：3种物质分别设置了不同的浓度梯度处理，其中氯化乙酰胆碱：1、10和100 μmol·L-1；左旋肉碱：0.1、1和5 mmol·L-1；肌醇：0.05、0.1和1 mmol·L-1。设置只添加1/4 MS营养液的处理作为空白对照（CK），每个处理设置6个生物学重复。每隔3 d更换一次三角瓶和营养液，更换三角瓶时按照处理浓度补充物质，培育期间定期观察记录黄瓜植株的生长状态，培养7 d后收苗并测量植株生长指标。

1.2.10 植株生长指标测定 植株叶面积用“长宽乘积法”计算，即根据黄瓜叶片长度和叶片最大宽度的乘积，再除以校正系数1.19可得到黄瓜叶片的面积[16]；茎粗使用游标卡尺进行测量；株高使用直尺测量；叶片叶绿素测量采用SPAD-502叶绿素仪测量新长成叶，选取叶片上5个点，去除偏差较大的值后取平均值；地上部/地下部鲜重选用百分之一天平称量；地上部/地下部干重是将新鲜的植株样品装入信封彻底烘干后使用万分之一天平称量。

植株根系数据分析：将根系样品放入样品盘中完全展开，样品盘预先加入适量清水，便于根样分散以减少根重叠，利用根系扫描仪Epson Expression 10000XL扫描根系。扫描结束后，利用分析软件进行图像分析及数据输出，主要选取指标为总根长、根尖数、总根表面积。

植株生长指标均为5株水培黄瓜幼苗植株数据，去掉最大最小值后取3个数据进行方差分析。

1.2.11 数据分析 采用IBM SPSS Statistics 21软件进行数据统计分析，采用单因素（one-way ANOVA）和Duncan法进行方差分析和多重比较（α=0.05），使用Origin9、AI作图，图表中数据为平均值±标准差。

2 结果

2.1 哈茨木霉菌NJAU 4742胞外蛋白分泌结果

图1为哈茨木霉菌NJAU 4742在水稻秸秆诱导下发酵5 d的上清液和浓缩后粗酶液的SDS-PAGE电泳分析结果及蛋白浓度测量结果。由图1可见，木质纤维素酶主要分布在100—40 kDa之间，图1-A胶图条带显示，硫酸铵沉淀法可以较好地浓缩发酵上清液中这部分的蛋白。浓缩后粗酶液的蛋白浓度相比浓缩前提高了10倍左右（图1-B）。

图A为胞外蛋白的电泳图，图B为不同样品的蛋白浓度；T1：哈茨木霉菌NJAU 4742在水稻秸秆诱导下发酵5 d的上清液；T2：将T1进行硫酸铵沉淀后的粗酶液

2.2 水稻秸秆酶解液的黄瓜水培试验结果

外源添加水稻秸秆酶解液的黄瓜水培试验结果表明，水稻秸秆酶解液对黄瓜幼苗生长有促进作用。和CK相比，稀释50倍和稀释100倍处理的黄瓜幼苗新叶面积分别增加了546.16%和474.95%；叶绿素含量增加了44.55%和40.59%；茎粗分别增加了16.19%和22.38%；株高分别增加了16.07%和21.43%；地上部干重分别增加了44.01%和52.64%（图2-B、2-C、2-D，表1）。根系扫描结果表明，高浓度的秸秆酶解液会抑制黄瓜根系生长，稀释25倍处理的黄瓜幼苗的根系干重以及总根长、根表面积与CK相比都有所下降，而低浓度的酶解液对黄瓜根系生长影响不大，稀释50倍和稀释100倍的处理则可以明显促进黄瓜根系发育，和CK相比，其根系干重分别增加了54.08%和55.05%（图2-E），根尖数分别增加了33.48%和31.95%（表1）。

图2 水稻秸秆酶解液对黄瓜幼苗生长的影响

表1 水稻秸秆酶解液对黄瓜幼苗部分生长指标的影响

CK：1/4MS营养液培养（空白对照）；200：水稻秸秆酶解液稀释200倍处理黄瓜幼苗；100：秸秆酶解液稀释100倍处理黄瓜幼苗；50：秸秆酶解液稀释50倍处理黄瓜幼苗；25：秸秆酶解液稀释25倍处理黄瓜幼苗。数据后不同字母表示处理间在＜0.05 水平差异显著

CK: 1/4MS nutrient solution culture (blank control); 200: rice straw enzymatic hydrolysate diluted 200 times to treat cucumber seedlings; 100: rice straw enzymatic hydrolysate diluted 100 times to treat cucumber seedlings; 50: rice straw enzymatic hydrolysate diluted 50 times to treat cucumber seedlings; 25: rice straw enzymatic hydrolysate diluted 25 times to treat cucumber seedlings. Different letters in the same column indicate significant differences between treatments at 0.05 level

2.3 水稻秸秆高温浸提液的黄瓜水培试验结果

外源添加水稻秸秆高温浸提液的黄瓜无菌水培试验结果表明（图3和表2）。在黄瓜水培体系中外源添加不同稀释倍数的水稻秸秆高温浸提液均能不同程度地促进黄瓜生长，其中促生效果最佳的为稀释50倍和稀释25倍的处理。与CK相比，用稀释50倍的高温浸提液处理的黄瓜植株的新叶面积和叶绿素含量分别增加了187.14%和12.20%。而稀释25倍处理的黄瓜植株的新叶面积和叶绿素含量分别增加了294.96%和33.33%。和CK相比，稀释50倍处理的植株在茎粗和株高上分别增加了13.66%和55.56%；而稀释25倍处理的植株分别增加了14.69%和55.56%。外源添加水稻秸秆高温浸提液还能明显促进黄瓜的根系发育，与CK相比，稀释100倍、50倍、25倍处理的根系干重分别增加了18.24%、63.38%和55.27%。根系扫描分析结果表明，外源添加水稻秸秆高温浸提液对植物根系的最大影响体现在根尖数量的变化上，4种不同稀释倍数处理的根尖数量均有不同程度的增加，稀释200倍、100倍、50倍和25倍处理的根尖数与CK相比，分别增加了10.33%、33.73%、64.44%和52.65%。

图3 水稻秸秆高温浸提液对黄瓜幼苗生长的影响

表2 水稻秸秆高温浸提液对黄瓜幼苗部分生长指标的影响

CK：1/4MS营养液培养（空白对照）；200：水稻秸秆高温浸提液稀释200倍处理黄瓜幼苗；100：高温浸提液稀释100倍处理黄瓜幼苗；50：高温浸提液稀释50倍处理黄瓜幼苗；25：高温浸提液稀释25倍处理黄瓜幼苗。数据后不同字母表示处理间在＜0.05水平差异显著

CK: 1/4MS nutrient solution culture (blank control); 200: rice straw high-temperature extract diluted 200 times to treat cucumber seedlings; 100: rice straw high-temperature extract diluted 100 times to treat cucumber seedlings; 50: rice straw high-temperature extract diluted 50 times to treat cucumber seedlings; 25: rice straw high-temperature extract diluted 25 times to treat cucumber seedlings. Different letters in the same column indicate significant differences between treatments at 0.05 level

2.4 液质联用结果

2.4.1 二级质谱定性结果 为进一步研究水稻秸秆中的促生成分，分别对水稻秸秆高温浸提液以及酶解液进行UHPLC-QE-MS非靶标检测，图4为水稻高温浸提液及酶解液的LCMS总离子流图。结果表明，水稻秸秆高温浸提液的出峰时间较为分散，主要出峰时间段为1—6 min（图4-A），而酶解液中物质的出峰时间段集中在5—7 min之间（图4-B）。液质联用结果表明高温浸提相比酶解对水稻秸秆中的功能物质释放的效果更为明显。对待测样品进行峰识别、峰提取等处理后，基于BiotreeDB自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，在水稻秸秆高温浸提液中定性到714种物质，而在水稻秸秆酶解液中通过二级质谱共定性到638种物质。

A：水稻秸秆高温浸提液；B：水稻秸秆酶解液 A: Rice straw high-temperature extract; B: Rice straw enzymatic hydrolysate

为进一步缩小促生物质筛选范围，本研究设置了对照处理（水稻秸秆酶解过程中设置的灭活对照，即在酶解体系中加入经过煮沸30 min处理的粗酶液）并对其进行了LCMS定性分析。黄瓜水培试验结果表明，灭活对照处理的上清液不具有促生效果（数据未显示），因此，在进行二级质谱定性物质筛选时，可以优先筛选在对照处理中未鉴定到但在酶解液/高温浸提液样品中相对含量较高的物质。

2.4.2 二级质谱定性物质筛选 在LCMS液质联用分析结果中，我们将水稻秸秆高温浸提液及酶解液与CK（灭活对照）进行对比分析，根据二级质谱打分值（MS2 score ＞0.8）和值（＜0.05）进行筛选，筛选出3种可能的促生物质，结果如表3所示，它们分别是乙酰胆碱、左旋肉碱和肌醇。乙酰胆碱和左旋肉碱均为含氮化合物，一般选用ESI正离子模式检测，而肌醇容易失去质子带负电荷，一般在ESI负离子模式中被检测到。二级质谱定性结果表明，乙酰胆碱、左旋肉碱在水稻秸秆高温浸提液和酶解液中均存在，并且在水稻秸秆高温浸提液中的相对含量要大于酶解液，而肌醇在水稻秸秆酶解液中的相对含量更大。3种物质的二级质谱图及其化学结构式如图5所示。

表3 二级质谱筛选结果

2.5 外源添加二级质谱定性物质促生试验结果

在黄瓜培养体系中外源添加不同浓度的氯化乙酰胆碱，结果表明，1、10、100 μmol·L-1浓度的氯化乙酰胆碱均能促进黄瓜植株的生长，主要表现在新叶面积、植株茎粗、叶绿素含量以及植株干鲜重的增加上（图6-A）。其中1 μmol·L-1处理的黄瓜植株和CK相比，新叶面积增加了103.91%；叶绿素含量增加29.44%；植株茎粗增加了16.46%（表4），植株地上部干重增加54.69%，根系干重增加了73.67%（图6-A）。根系扫描结果表明，外源乙酰胆碱也能促进黄瓜根系的生长，主要体现在植株总根长、根表面积以及总根尖数的增加上（表4）

在黄瓜水培体系中外源添加不同浓度的左旋肉碱（0.1、1和5 mmol·L-1），结果表明，在0.1 和1 mmol·L-1浓度下，外源左旋肉碱可以促进黄瓜植株的生长，与CK相比，新叶面积分别增加了40.22%和23.85%；叶绿素含量分别增加了9.10%和14.68%；植株茎粗分别增加了12.80%和12.20%（表4），地上部干重分别增加了33.79%和30.19%，根系干重分别增加了44.97%和48.82%（图6-B）。根系扫描结果和地上部生长指标结果一致，0.1 mmol·L-1以及1 mmol·L-1浓度的左旋肉碱能够促进黄瓜根系生长，而5 mmol·L-1浓度处理和CK处理之间差异不明显（表4）。上述结果均表明，在适宜浓度下，左旋肉碱能够起到促进黄瓜幼苗生长的作用。

图5 筛选物质的二级质谱图

图6 不同浓度的氯化乙酰胆碱、左旋肉碱和肌醇对黄瓜幼苗生长的影响

在黄瓜水培体系中分别添加0.05和0.1 mmol·L-1浓度的外源肌醇可以促进黄瓜生长。与CK处理相比，新叶面积分别增加了66.42%和51.56%；叶绿素含量分别增加了22.65%和24.04%；植株茎粗分别增加了20.43%和16.46%（表4），地上部干重分别增加了36.66%和30.15%，根系干重增加了69.82%和51.78%（图6-C）。根系扫描结果表明，0.05和0.1 mmol·L-1的外源肌醇能够促进黄瓜根系生长发育，和CK处理相比，其总根长和侧根数量都明显增长；但1 mmol·L-1浓度处理和CK相比，植株地上部和地下部生长都受到了明显抑制（表4）。结果表明外源肌醇在适宜浓度下才能起到促进黄瓜生长的作用。

表4 不同浓度的氯化乙酰胆碱、左旋肉碱和肌醇对黄瓜幼苗部分生长指标的影响

数据后不同字母表示处理间在＜0.05水平差异显著

Different letters in the same column indicate significant differences between treatments at 0.05 level

3 讨论

水稻秸秆是农业生产上主要的废弃物之一，研究发现许多农业废弃物是生物效应剂的潜在来源，对种子萌发有促进作用[17]。水稻秸秆成分较为复杂，含有大量的纤维素、半纤维素、木质素和少量的矿质元素，目前对水稻秸秆的再利用方式主要有秸秆焚烧、秸秆还田以及秸秆的资源化利用[18]。如何提高秸秆的资源化利用效率是当前研究重点。本研究主要集中讨论水稻秸秆经过水热处理以及哈茨木霉菌分泌的胞外蛋白酶解处理后的成分对作物生长是否有促进作用。JIA 等[19]研究发现，稻草的水热处理会导致其半纤维素减少，同时纤维素和木质素含量增加。稻草中存在简单的酚类化合物，它们在处理过程中可能以细胞壁多糖片段的酯形式释放到溶液中。MA等[15]研究了秸秆中的生物活性物质对番茄幼苗生长的促进作用。经盆栽试验证实，秸秆的裂解物主要由多酚类物质和多糖组成，能促进番茄幼苗生长。这一系列研究结果表明，水稻秸秆的水热处理是一种可行的利用方式，具有较好的生物效应和发展成生物肥料的潜力。稻草的酶解产物中包括多种不同的化合物，例如芳香醇、芳香酚、小分子醛、脂质和烯烃等[20]。纤维素酶是生物降解过程中的关键酶。它们由三大类酶组成：内切葡聚糖酶；纤维蛋白水解酶和β-葡萄糖苷酶[21-22]，这些酶主要由真菌产生，包括木霉和曲霉[21]。木霉菌因其高产纤维素酶而被广泛研究[23]。黄瓜水培试验结果表明，哈茨木霉菌NJAU 4742酶解水稻秸秆后的酶解液能显著促进黄瓜幼苗生长发育，在适宜浓度下，可以显著促进黄瓜幼苗的新叶萌发、提高黄瓜叶片的叶绿素含量以及植株地上/地下部干物质的积累。研究发现，在设置的4个浓度梯度中，水稻秸秆高温浸提液稀释25倍和稀释50倍这两种处理的植株生长指标相差不大，表明外源添加的水稻秸秆高温浸提液达到一定浓度后，其促生效果将不再随着浓度上升。同样在水稻秸秆酶解液处理的水培试验中，发现外源加入的酶解液浓度过高时，其促生作用大幅度下降，和对照相比，酶解液稀释25倍处理对黄瓜根系发育有明显抑制作用。这可能是因为秸秆酶解产物中存在某些刺激性物质，这些物质在浓度过高时反而不利于黄瓜幼苗的生长。

为了进一步研究水稻秸秆高温浸提/酶解后的成分，对水稻秸秆高温浸提产物以及酶解产物进行UHPLC-QE-MS非靶标检测。LCMS中ESI正离子模式适用于检测大部分化合物，通过二级质谱比对分析，在水稻秸秆高温浸提液中鉴定出714种物质，在水稻秸秆酶解液中鉴定出638种物质。由于水稻秸秆成分的复杂性，二级质谱结果中两种产物的定性物质数量过多，为了进一步缩小筛选范围的同时尽可能保证定性结果的准确性，将两种产物和对照组中定性到的物质进行比较分析，再结合值和二级质谱打分值进行筛选，主要选择了乙酰胆碱、左旋肉碱和肌醇这3种具有代表性的物质进行研究，根据已有文献报道，它们对作物生长可能有不同程度的促进作用[24-26]。乙酰胆碱（ACh）是一种季铵化合物，类似于植物激素，也是一种神经递质，存在于微生物、植物和动物的非神经组织或器官中[27]。越来越多的证据表明乙酰胆碱具有非神经元功能，外源乙酰胆碱在10-7—10-3mol·L-1浓度范围内具有促进植物根系生长的作用[24,28]。本研究的结果表明，外源乙酰胆碱在1、10 和100 μmol·L-1均能显著提高黄瓜植株的叶绿素含量和干重等生长指标，同时能明显促进黄瓜根系的侧根发育。左旋肉碱，又名维生素BT，属于季铵盐类化合物。动物、细菌、真菌和植物均可自然合成左旋肉碱[29-30]。有研究表明，外源施用1 mmol·L-1左旋肉碱可以通过增加有丝分裂和减少氧化应激对大麦幼苗DNA的损伤来减轻盐胁迫对植物的有害影响[31]。外源左旋肉碱还能赋予拟南芥幼苗更好的抗氧化胁迫能力，从而提高其对过氧化氢供应的反应的存活率；同时，左旋肉碱对脱落酸信号通路具有拮抗作用[25]。我们在黄瓜水培试验中，分别在黄瓜根系外源添加了3种不同浓度的左旋肉碱，结果表明，在0.1和1 mmol·L-1浓度下，外源左旋肉碱可以促进黄瓜植株的生长。在水稻秸秆高温浸提产物和酶解产物中，通过液质联用还鉴定出大量的乙酰左旋肉碱，乙酰左旋肉碱也称为ALCAR，是左旋肉碱的乙酰化形式，其具有和左旋肉碱相似的功能，在脂肪酸氧化过程中促进乙酰辅酶A（CoA）进入线粒体的吸收，增加乙酰胆碱的产生，并触发膜磷脂和蛋白质的合成[32]。肌醇是植物组织培养基中最常用的四种维生素之一，属于维生素B复合物的一种。肌醇不仅可以支持植物的抗氧化防御系统，还可以通过调节Na+、K+的稳态和渗透平衡来减轻盐胁迫对植物生理过程的抑制作用[33]。肌醇对植物的正常生长发育起着重要作用。研究表明，在干旱条件下，外源性肌醇显著增加了叶片水势和相对含水量。与水结合的肌醇可以作为脯氨酸有效维持细胞充盈。外源性肌醇会降低植物的H2O2、AP和CAT活性以及膜损伤和脯氨酸水平，可以通过保护叶片水分状况来减轻干旱胁迫的危害[26]。本研究通过液质联用在ESI负离子模式下，从水稻秸秆酶解产物中检测到肌醇的存在，并且发现其相对含量远高于水稻秸秆高温浸提产物，同时通过黄瓜水培试验也发现，在合适的浓度下，外源肌醇也能够促进黄瓜幼苗生长。

4 结论

水稻秸秆中存在能促进植物生长的功能物质，这些物质可利用高温浸提和酶催化水解作用被释放到溶液中，通过液质联用在水稻秸秆的高温浸提产物及酶解产物中鉴定筛选出乙酰胆碱、左旋肉碱以及肌醇3种典型的促生小分子物质，并发现其均能显著促进黄瓜幼苗的生长。本研究的结果为农业废弃物资源化利用提供新的方向，具有很好的应用前景。

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Identification of Functional Substances from Rice Straw Obtained by Pyrolysis and Enzymolysis and Its Effect

TANG SiYu, LIU QiuMei, MENG XiaoHui, MA Lei, LIU DongYang, HUANG QiWei, SHEN QiRong

Jiangsu Key Laboratory for Organic Solid Waste Utilization, Nanjing Agricultural University/Jiangsu Collaborative Innovation Center for Solid Organic Waste Resource Utilization, Nanjing 210095

【】To explore the effect of agricultural wastes (rice straw) on plant growth, the identification and analyzation of the small molecules that may exist in the high-temperature extracts and enzymolysis solution of rice straw were performed, and the promoting effect of these substances on cucumber growth was also evaluated.【】The high-temperature extract solution of rice straw was prepared by high temperature water extraction at 115℃ for 30 min. The condensation of the extracellular proteins fromNJAU 4742 under the induction of rice straw was obtained by ammonium sulfate precipitation method, which was used to hydrolyze the rice straw to prepare rice straw enzymatic hydrolysate. The high-temperature extract and enzymolysis solution of rice straw were diluted into different times, and the growth-promoting effects were verified by cucumber hydroponic experiment. The high-temperature extract and enzymatic hydrolysis of rice straw were identified and compared by UHPLC-QE-MS non-target metabolomics detection technology. Under the control of the acquisition software (Xcalibur 4.0.27, Thermo), the QE mass spectrometer collects primary and secondary mass spectrometry data in the information-related acquisition mode for the high-temperature extract and enzymatic hydrolysate of rice straw. Through the self-written R program package (the kernel was XCMS), the original data was processed for peak identification, peak extraction, peak alignment and integration, and then it was matched with the BiotreeDB (V2.1) self-built MS database for substance annotation. Finally, the growth-promoting effects of some identified substances were verified by the cucumber hydroponic experiment.【】The results showed that both high-temperature extract and enzymatic hydrolysate liquid of rice straw could promote the growth of cucumber seedlings at appropriate concentrations, and the enzymatic hydrolysate of rice straw showed significant growth promoting effect on cucumber when diluted for 100 times. Compared with the CK, the dry weight of overground part, underground part and plant height of cucumber plants treated with 100 times dilution increased by 52.64%, 55.05% and 21.43%, respectively, and the number of plant root tips increased by 31.95%. The high-temperature extract of rice straw owned the best growth promotion effect when it was diluted 50 times, in which the dry weight of overground part, the underground part and the plant height of cucumber plants increased by 44.16%, 63.38% and 55.56%, respectively, and the number of plant root tips increased by 64.44%, compared with CK. The UHPLC-QE-MS non-target detection technology results showed that 714 different substances were identified in the high-temperature extract of rice straw and 638 different substances were identified in the enzymatic hydrolysis solution, among which acetylcholine, L-carnitine and myo-inositol were screened out. Meanwhile, the standard products of these three substances were added to the cucumber root system, and the results showed that they all had considerable promotion effect on cucumber growth. Acetylcholine at the concentration of 1 μmol·L-1, 10 μmol·L-1and 100 μmol·L-1could all promote the growth of cucumber. Compared with CK, the exogenous acetylcholine at 1 μmol·L-1concentration increases the dry weight of cucumber shoots by 54.69% and the dry weight of roots by 73.67%, the number of root tips increased by 130.5%; Exogenous L-carnitine was beneficial to the growth of cucumber plants at the concentration of 0.1 mmol·L-1and 1 mmol·L-1. Compared with CK, the dry weight of cucumber shoots increased by 33.79% and 30.19%, and the dry weight of roots increased by 44.97% and 48.82%, the number of cucumber root tips increased by 41.8% and 49.9%, respectively; Exogenous myo-inositol at the concentration of 0.05 mmol·L-1and 0.1 mmol·L-1could promote the growth of cucumber. Compared with CK, the dry weight of cucumber shoots increased by 36.66% and 30.15%, roots dry weight increased by 69.82% and 51.78%, and the number of cucumber root tips increased by 149.0% and 96.7%, respectively.【】In brief, both the high-temperature extract and the enzymatic hydrolysate of rice straw could significantly promote the growth of cucumber, and the acetylcholine, L-carnitine and myo-inositol were detected by LCMS in the pyrolysis and enzymatic hydrolysate of rice straw, which were considered as the functional substances in rice straw.

rice straw; high-temperature extraction; enzymatic hydrolysis; LCMS; growth promotion

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.15.010

2020-09-20；

2020-12-17

国家自然科学基金（31972513）、江苏省农业科技自主创新资金（CX(18)3059）、江苏省重点研发计划（现代农业）（BE2018338）

唐思宇，E-mail：2018103144@njau.edu.cn。通信作者刘东阳，Tel：025-84396853；E-mail：liudongyang@njau.edu.cn

（责任编辑 李云霞）