甲状腺良恶性结节的基因变异差异比较

张润娇 董莉 刘芃芃 张蕊 韩雷 程亚楠 于津浦

作者单位：天津医科大学肿瘤医院肿瘤分子诊断中心，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室（天津市300060）

甲状腺结节是头颈部最常见的疾病，其中5%～15%的甲状腺结节为恶性。近年来，甲状腺癌的患病率不断上升，数据显示全球范围内女性甲状腺癌的发病率在恶性肿瘤中占第7 位[1-2]，中国女性恶性肿瘤中甲状腺癌的发病率占第4 位[3]。甲状腺癌起源于甲状腺滤泡上皮细胞或滤泡旁细胞，其病理类型包括分化型甲状腺癌、未分化型甲状腺癌和甲状腺髓样癌，其中分化型甲状腺癌中的甲状腺乳头状癌最为常见（70%～80%）[4]。

良恶性甲状腺结节的临床处理方式差别较大。因此，甲状腺结节的评估要点主要是良恶性的鉴别。甲状腺癌是一类多基因变异的疾病，常见变异类型为基因突变和融合。近年来，随着二代测序技术的普及，甲状腺癌的基因变异谱研究受到越来越多的关注。有研究表明，甲状腺良恶性结节患者的临床病理特征并不一致，且针对甲状腺良恶性结节基因变异的研究也越来越多，但是针对两者之间多基因变异差异的组学研究相对较少[5-8]。本研究通过二代测序对187 例甲状腺结节和81例癌旁正常甲状腺组织进行基因变异差异的分析，进一步为甲状腺结节良恶性鉴别寻找有效的分子标志物。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选择2014年12月至2018年5月天津医科大学肿瘤医院甲状腺癌患者187 例，其中男性46 例，女性141例，年龄21～72 岁，平均年龄45.47 岁。另选取同期81例癌旁正常甲状腺组织。样本来自甲状腺细针穿刺手术过程中取样或甲状腺腺叶切除术术中取样。

1.2 方法

1.2.1 甲状腺细针穿刺活检 患者取仰卧位，垫肩，颈部过伸，充分暴露颈前区，超声引导应用高频线阵探头，频率12 MHz，对甲状腺进行常规检查，并消毒颈前区，2%利多卡因对手术部位进行局部麻醉，穿刺针（23 G×8 cm）于超声定位点进针，到达病灶区，吸出组织液注于组织固定液（4%多聚甲醛）内，送检细胞学及基因测序。

1.2.2 组织DNA 和RNA 提取 利用DNA 提取试剂盒（德国Qiagen 公司）和RNA 提取试剂盒从组织固定液中的组织中分别提取DNA 和RNA，应用NanoDrop One 微量核酸蛋白浓度测定仪检测双链DNA 和RNA 的浓度，保证DNA/RNA 的吸光度比值（A260/A280）为1.8～2.0。

1.2.3 高通量测序 组织样本中提取到的RNA 通过RT-PCR 逆转录为cDNA，将在组织样本中提取的DNA 样本和逆转录得到的cDNA 样本进行基因组定量后，通过磁珠筛选再用捕获探针杂交，将最终筛选出的杂交体通过PCR 进行扩增，上机测序并进一步进行文库构建。测序在Illumina MiSeq 平台上进行，平均测序深度为2 811×。基因检测Panel 对突变的检测包括MUC12、AKT1、ANKRD36、APC、ATM、BRAF、BRCA1、C18orf10、CDC27、CHEK2、COMP、CTNNB1、EGFR、EIF1AX、FRG1、FRG2C、GGT1、GNAS、HLA-A、HRAS、IDH1、IGSF3、KIAA0430、KRAS、KRTAP4-8、KRTAP9-1、MLL、MLL3、MUC6、NEFH、NRAS、OBSL1、OTOP1、OTUD4、PIK3CA、POTED、PRAMEF2、PTEN、RET、SYVN1、TAS2R31、TERT、TP53、TSHR、ZNF717、EZH1、SPOP、ZNF148 共48 个基因；融合检测包括BRAF、NTRK1、NTRK3、ALK、PPARG、THADA、MAML2 和RET 共8 个基因，涵盖CCDC6-RET（3）、GOLGA5-RET、ETV6-NTRK3（2）、HOOK3-RET、KTN1-RET、ERC1-RET、NCOA4-RET（4）、AKAP9-BRAF、PAX8-PPARG（4）、PCM1-RET、TGF-NTRK1（2）和TPM3-NTRK1 等36种融合类型。

1.2.4 基因变异检测结果分析 采用FASTQC 和Trimmomatic 软件对测序数据的质量进行评估。使用BWA-MEM 软件包，将测序数据回帖至人类参考基因组（GRCh37/hg19）。将Fastq 文件使用Sentieon（https://support.sentieon.com/manual/）和Starfusion 软件（https://github.com/STAR-Fusion/STAR-Fusion/wiki）分别得到SNP Indel 和融合的位点结果。其中SNP Indel 的vcf 结果基于2019 版Annovar 工具及注释库（https://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/）注释相关数据库信息（包括ClinVar、COSMIC、dbnsfp、dbscsnv、dbsnp、esp6500、exac、g1000、gnomad、HGMD、ICGC 和refGene 等），获得SNP Indel注释结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。所有计数资料的比较采用χ2检验或Fisher 精确检验。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 数据质量评估

在基于目标区域富集的二代测序的甲状腺结节基因变异检测中，所有测序数据的Q30 均>87%，目标区域测序深度范围为165～7 104×，平均测序深度为2 811×。测序读段的长度分布在120～150 bp。平均98.1%的测序读段可以比对至基因组。提示探针捕获效率具有较好的可重复性，测序数据的可靠性高。

2.2 突变检出情况

本研究共检测出突变476 个，累计突变基因40 个，包括错义突变、框移突变、插入/缺失突变和无义突变。突变基因分为驱动基因和非驱动基因两大类，驱动基因又分为功能获得型驱动基因（BRAF、RET、CTNNB1、IDH1、NRAS、HRAS、KRAS、AKT1、PIK-3CA、TERT、GNAS）和功能缺失型驱动基因（TP53、PTEN、CDC27、APC、ZNF717）；非驱动基因包括DNA 损伤修复基因（CHEK2、ATM、BRCA1、OTUD4），免疫相关基因（HLA-A、MUC6、IGSF3），染色体重塑相关基因（KMT2C、PRAMEF2、NEFH、KMT2A），膜转运相关基因（TAS2R31、OBSL1、SYVN1、MUC-3A），激素相关基因（TSHR），代谢相关基因（OTOP1、GGT1），角蛋白相关基因（KRTAP9-1、KRTAP4-8），锚蛋白相关基因（POTED、ANKRD36）和其他基因（FRG2C、TPGS2），见图1。

图1 癌组织、可疑良性结节与正常组织3 组的基因突变占比

根据细胞学或病理学结果，187 例甲状腺结节样本分为甲状腺癌129 例（乳头状癌124 例、髓样癌4 例、肉瘤样癌1例）和可疑良性结节58 例。甲状腺癌样本的突变基因37 个，可疑良性结节的突变基因35 个。对癌组织、可疑良性结节与正常组织3 组的基因变异整体分析发现，与正常组织相比，癌组织和可疑良性结节发生突变的基因较多，且各基因的突变位点也较多。其中，驱动基因（BRAF、RET、PIK3CA、HRAS、TERT、APC、PTEN、ZNF717）、DNA 损伤修复基因（ATM、CHEK2、OTUD4）、免疫相关基因（HLA-A、IGSF3）、染色体重塑相关基因（KMT2C、PRAMEF2）等在癌组织和可疑良性结节中突变占比均显著高于正常组织（均P<0.05）。

2.3 甲状腺良恶性结节基因变异差异分析

在癌组织中，BRAF（P<0.001）、ZNF717（P=0.031）、TERT（P=0.049）、GGT1（P=0.008）、CHEK2（P=0.014）、OTUD4（P<0.001）、RET 蛋白激酶域（P=0.047）的突变占比和基因融合的发生频率（P=0.045）均显著高于可疑良性结节。而HRAS（P=0.134）、KRAS（P=0.103）、NRAS（P=0.182）、PIK3CA（P=0.987）、PTEN（P=0.104）和AKT1（P=0.340）等基因的突变占比在两组间无显著性差异。

BRAFV600E突变是甲状腺乳头状癌最常见的突变类型，是甲状腺结节良恶性鉴别的重要指标。本研究在癌组织和可疑良性结节中均检测出BRAFV600E突变，其中癌组织93 例（72.09%），可疑良性结节10 例（17.24%），两者比较有显著性差异（P<0.001）。除BRAFV600E外，同样检测出BRAF 其他位点的突变，这些位点主要分布于BRAF 蛋白的酪氨酸激酶结构域。与BRAFV600E突变不同，BRAF 非V600E 突变在癌组织中仅检出1例（0.78%），而在可疑良性结节中检出10 例（17.24%），且突变占比在两组有显著性差异（P<0.001）。

RET 蛋白激酶域突变在癌组织中突变占比显著高于可疑良性结节（P=0.047），并且在癌组织中，RET功能域突变与淋巴结转移呈正相关（P=0.036）。除RET 蛋白激酶域突变外，GGT1 在癌组织突变占比显著高于可疑良性结节，且该基因突变同样与甲状腺癌淋巴结转移呈正相关（P=0.02），见表1，2。

表1 BRAF 等突变基因与甲状腺癌患者临床病理特征的相关性分析 例

2.4 甲状腺良恶性结节突变通路差异分析

对突变基因涉及的相关通路进行分析发现，PI3K/Akt 通路（P=0.053）和AMPK 通路（P=0.023）相关基因的突变占比在癌组织中显著高于可疑良性结节，且在癌组织中，PI3K/Akt 通路（P=0.060）和AMPK 通路（P=0.056）的基因突变与淋巴结转移呈正相关趋势（表3）。

表3 突变基因相关通路与甲状腺癌患者临床病理特征的相关性分析 例（续表3）

表3 突变基因相关通路与甲状腺癌患者临床病理特征的相关性分析 例

表2 OTUD4 等突变基因与甲状腺癌患者临床病理特征的相关性分析 例

2.5 甲状腺良恶性结节基因融合差异分析

在癌组织中，基因融合的占比显著高于可疑良性结节[分别为13 例（10.08%）和1例（1.72%），P=0.045]。14 例检出的融合类型有CCDC6-RET（RET/PTC1）、NCOA4-RET（RET/PTC3）、ETV6-NTRK3 和TPM3-NTRK1，其中癌组织中检出CCDC6-RET 2 例（1.55%），融合部位为CCDC6 第1 外显子和RET 第12 外显子；NCOA4-RET 检出5 例（3.88%），融合部位为NCOA4 第8 外显子和RET 第12 外显子；ETV6-NTRK3 检出5 例（3.88%），融合部位为ETV6 第4 外显子和NTRK3 第14 外显子；TPM3-NTRK1 检出1例（0.78%），融合部位为TPM3 第7 外显子和NTRK1 第10 外显子；良性结节检出1例的融合部位为NCOA4-RET。各检出融合部位均与甲状腺癌最常见的融合部位相一致。

3 讨论

甲状腺癌是一类多基因变异的疾病，在甲状腺癌的发生发展中，驱动基因变异发挥着重要作用。有研究表明，甲状腺癌并非起源于甲状腺良性结节，而且甲状腺良性结节与甲状腺癌的突变背景不同[5-10]。本研究通过对187 例甲状腺结节和81例癌旁正常甲状腺组织进行二代基因测序并进行变异的差异分析发现，甲状腺癌的基因变异特征与可疑良性结节存在明显差异，虽然癌组织和可疑良性结节在部分基因的突变占比方面差异不显著，但是癌组织在BRAF、TERT、ZNF717、GGT1、CHEK2、OTUD4、RET、PI3K/Akt 通路相关基因的突变占比以及基因融合的发生频率均显著高于可疑良性结节，这些基因或可以辅助甲状腺结节良恶性的鉴别。与甲状腺癌相比，甲状腺可疑良性结节中已有驱动基因的改变（BRAF、PIK3CA、ZNF717、TERT、HRAS、KRAS、NRAS、PTEN、RET），这说明分子事件在表型改变前已经启动。

BRAFV600E突变是目前已知甲状腺结节良恶性鉴别的重要指标[11]，本研究在可疑良性结节组检出的10例BRAFV600E突变样本可能并不完全为良性而更倾向于恶性，提示单纯的细胞学检查结果并不一定可以完全准确的确定样本类型，需要同时结合二代测序来提高检测的敏感度，从而降低漏诊率。

RAS 基因的突变与肿瘤发生相关，在甲状腺乳头状癌中，RAS 的突变占比为10%～20%，其中NRAS第61 密码子和HRAS 第61 密码子的突变最为常见[12-13]。有报道，在组织学良性的甲状腺结节中可见HRAS、KRAS 和NRAS 突变[14-16]，而且有研究证明单纯的RAS 突变并不一定能使良性的甲状腺结节细胞转变为恶性[16]，此发现与本结果相一致，因此RAS 突变并不能够作为区分甲状腺结节良恶性的独立指标。

TERT 基因编码端粒酶逆转录酶，其最常见的突变位点为启动子第124 位点和第146 位点C 至T 的改变（C228T 和C250T），此改变可以调控端粒酶活性，使细胞内的端粒酶数量增多和活性增强，从而延缓细胞的凋亡过程，促进肿瘤的形成[17-19]。本研究检测出的TERT 突变多集中于端粒酶核糖核蛋白复合物-RNA 结合域，而且突变以R488H 最为多见。该结构域的突变可能改变端粒酶DNA 的动态，破坏DNARNA 复合物的稳定性，从而加强端粒酶的持续合成能力[20-22]。而TERT 在癌组织中的突变占比显著高于可疑良性结节，提示TERT 可以作为辅助甲状腺结节良恶性鉴别的指标。

RET 基因的激活性点突变在甲状腺髓样癌中最为常见，而RET 基因在甲状腺乳头状癌中的突变占比则远小于甲状腺髓样癌（>80%）[23]。本研究结果显示，RET 功能域突变和RET 融合在癌组织中突变占比显著高于可疑良性结节，但在正常组织中无突变；在癌组织中，RET 蛋白激酶域突变与淋巴结转移呈正相关，提示RET 可以作为辅助甲状腺良恶性鉴别和判断转移状态的一个重要指标。

DNA 损伤修复基因CHEK2 和OTUD4 在癌组织中突变占比显著高于可疑良性结节，这表明可疑良性结节中DNA 损伤修复基因未发生太多改变；而且CHEK2 和OTUD4 与ZNF717、TSHR、TERT、PIK3-CA 等基因有明显的伴发突变现象，提示DNA 损伤修复缺陷与其他突变基因协同参与甲状腺癌的形成，DNA 损伤修复基因也可能作为辅助甲状腺结节良恶性鉴别的指标。

PI3K/Akt 通路和AMPK 通路在甲状腺癌的发展过程中发挥主要作用，PI3K/Akt 通路和AMPK 通路通过调节细胞生长、凋亡、免疫、代谢和自噬等过程而诱导甲状腺细胞发生癌变[24-29]，而本研究对突变基因涉及的通路与淋巴结转移的相关性分析中也发现，PI3K/Akt 通路和AMPK 通路相关基因的突变占比在癌组织显著高于可疑良性结节，且在癌组织中，PI3K/Akt通路和AMPK 通路基因突变同样与淋巴结转移呈正相关趋势，提示此两条信号通路不仅可用于辅助甲状腺结节良恶性鉴别，也可以辅助甲状腺癌的危险度预测。

此外，基因融合在甲状腺癌组织中的发生频率同样显著高于可疑良性结节，是辅助甲状腺结节良恶性鉴别的一个重要指标。基因融合可以使蛋白酪氨酸激酶表达活性异常，从而增强其自身激酶活性，进而激活下游信号分子，使细胞增殖调节紊乱而促进肿瘤的发生发展[30-34]。同时，本研究检测到的基因融合均为甲状腺癌靶向治疗的重要靶点，提示基因融合不仅可用于辅助良恶性鉴别也可以指导临床靶向药物选择。

通过二代测序技术，本研究在原有的BRAFV600E之外发现了新的分子标志物，该发现可以辅助甲状腺良恶性结节的鉴别并为甲状腺癌患者的临床治疗提供指导。由于经B 超和细针穿刺活检确定为良性结节的样本并未进行手术切除和病理学检测，所以不能确定这些样本的具体组织学亚型，本研究将样本分类为可疑良性结节组。BRAFV600E突变是目前已知甲状腺结节良恶性鉴别的重要指标，在可疑良性结节组检出的10 例BRAFV600E突变样本可能更倾向为癌组织。此10 例病例将进行密切的跟踪随访，以便观察其结节的变化情况。而在后续的研究中，在B 超和细针穿刺活检确定为良性结节之后，应进一步进行手术切除并通过病理学检测确定其具体的组织学亚型。而且，本研究中的一些统计有边缘效应，可能因为研究的样本例数较少，因此需要进一步增加样本量来提高统计学显著性，并且深入探究上述基因变异对甲状腺癌发生发展的影响。