miR-92a、ACE在冠心病合并2型糖尿病患者血清中的表达及其预后相关性

张威，许浩，余琴

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病，CHD），是冠状动脉（冠脉）血管处发生动脉粥样硬化病变引起血管腔阻塞或狭窄，进而引发心肌缺氧、缺血、坏死等心脏类慢性发展疾病[1]。糖尿病（DM）是由遗传、环境等因素引起的代谢性疾病，以高血糖为主要特征，常伴血管、心脏、神经等器官的功能性障碍[2]，2型糖尿病（T2DM）占总糖尿病患者的90%以上，资料显示我国糖尿病患病率较高，由其引发的心血管疾病、神经病变等并发症对社会及家庭造成沉重负担[3]，CHD是T2DM患者的常见并发症之一，二者相互影响、相互促进，形成恶性循环，严重影响患者生活质量。CHD合并T2DM患者主要有高血脂、高血压、肥胖、体力不支等特点[4]。近年来CHD合并T2DM发病人数逐年升高，致死率及致残率较高，预防和根治CHD合并T2DM的药物也尚未上市，关于CHD合并T2DM不良预后的研究较少。miRNA是一类可以参与血管生成、细胞增殖分化等生理过程的非编码单链RNA分子，与糖尿病存在一定关系[5]，研究发现miR-92a在T2DM患者体内呈现高表达，具有很好的疾病评估价值[6]。血管紧张素转化酶（ACE）是肾素-血管紧张-醛固酮系统的关键酶之一，具有催化血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ、调节人体内环境稳定等作用，对高血压、糖尿病等疾病的治疗和预后具有重要作用[7]。本研究通过对CHD合并T2DM患者血清中miR-92a、ACE的表达水平进行测定和分析，为CHD合并T2DM的不良预后提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组选择2017年4月至2018年4月于湖北医药学院附属国药东风总医院确诊的CHD患者205例，其中男性107例，女性98例，年龄43～77岁。纳入标准：CHD的确诊根据冠心病分级指南的诊断标准[8]，冠脉造影时左主干、右冠、前降支、回旋支主干或其主要分支血管狭窄程度≥50%；T2DM的确诊根据世界卫生组织1999年的诊断标准，出现多饮、多尿、多食、消瘦等症状，空腹血糖≥7.0 mmol/L、随机血糖≥11.1 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；入院主诉为胸闷、心悸等不良症状，心电图、心脏彩超等检查异常；入院后接受冠状动脉造影术等。排除标准：有肿瘤、急性炎症、感染性疾病等；肝功能受损严重者；难治性高血压。根据是否合并T2DM分为CHD合并T2DM组（100例）、CHD组（105例）。选取同期本院健康体检者115例为对照组，其中男性59例，女性56例，年龄46～75（63.81±13.80）岁。本研究经我院医学伦理学委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理采集CHD合并T2DM、CHD患者入院24 h及正常体检者空腹外周血3～5 ml，室温静置20 min，3000转 4℃离心10 min，收集血清至特定离心管中，于-80℃冰箱保存，用于后续RNA的提取和相应指标的测定。

1.2.2 qRT-PCR法检测血清miR-92a的表达水平利用RNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司）的要求提取血清总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TAKARA公司）反转录得到cDNA。采用实时荧光定量PCR法（qRTPCR）（美国Bio-Rad公司）对miR-92a进行扩增。qRT-PCR反应体系共20 μl：miScript SYBR® Green Mix 10 μl，cDNA（50 ng/μl）2 μl，上下游引物（10 μM）各1 μl，ddH2O 6.0 μl。反应条件：95℃预变性90 s；95℃变性30 s；62℃退火延伸30 s；72℃延伸15 s；共40个循环。miR-92a及内参U6的引物序列见表1。采用2-△△CT法对血清miR-92a表达水平进行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 ELISA法检测血清ACE表达水平取待测血清稀释液10 μl，加入酶标板中，经过37℃温育、洗涤液洗涤、加酶、温育、显色、终止显色等步骤后于450 nm处测定样品吸光度，根据标准曲线计算出血清ACE表达水平，具体操作步骤按照ELISA试剂盒（美国Invitrogen公司）中的说明书进行。

1.2.4 受试者临床指标的测定采用AU5800全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter公司）测定血清中三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖（GLU）、糖化血红蛋白（GHb）水平。

1.2.5 预后对患者进行为期1年的随访，观察起点为出院日，观察终点为心血管不良事件发生，主要有全因死亡、非致死性心肌梗死、靶病变血运重建、复发心绞痛等，记录发生心血管不良事件的患者例数。随访截止日期为2019年4月。

1.3 统计学方法所有数据均采用SPSS 25.0统计学软件分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间均数的比较采用t检验，三组间均数的比较采用单因素方差分析；计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。ROC法比较miR-92a、ACE以及二者联合检测对CHD合并T2DM的诊断价值，曲线下面积（AUC）比较采用U检验；CHD合并T2DM不良预后的影响因素采用Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较三组受试者年龄、性别、BMI间比较无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，CHD组、CHD合并T2DM组患者血清中TG、HDL-C水平均显著升高（P＜0.05），其中CHD组与CHD合并T2DM组之间比较无统计学意义（P＞0.05）；与对照组相比，CHD合并T2DM组患者血清中GLU、GHb水平显著升高，CHD组与对照组之间比较无统计学意义（P＞0.05），表2。

表2 两组患者一般临床资料比较

2.2 三组患者血清miR-92a、ACE mRNA表达水平比较对照组、CHD组、CHD合并T2DM组患者血清miR-92a mRNA表达水平分别为0.98±0.25、1.25±0.32、1.88±0.51；血清ACE表达水平分别为（32.97±6.25）U/L、（43.01±9.76）U/L、（46.97±11.20）U/L；与对照组比较，CHD组及CHD合并T2DM组患者血清的miR-92a表达水平和ACE表达水平均显著升高（P＜0.05），其中CHD合并T2DM组的表达水平高于CHD组，表3。

表3 三组患者血清miR-92a、ACE mRNA表达水平比较

2.3 预后良好与预后不良CHD合并T2DM患者间指标比较对CHD合并T2DM组患者进行随访1年，发生心血管不良事件（预后不良组）33例，预后良好组67例，预后不良发生率为33%，预后良好组与预后不良组性别、年龄、BMI指数、TC水平之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与预后良好组比较，预后不良组患者血清中TG、HDL-C、GLU、GHb、miR-92a表达水平和ACE表达水平均显著升高（P＜0.05），表4。

表4 预后良好与预后不良CHD合并T2DM患者间指标比较

2.4 血清miR-92a、ACE表达水平对CHD合并T2DM患者不良预后的诊断价值ROC曲线结果表明，血清miR-92a表达水平诊断CHD合并T2DM不良预后曲线下面积（AUC）为0.776（95%CI：0.675～0.873），敏感度为72.7%，特异性为79.1%，截断值为1.650；血清ACE表达水平诊断CHD合并T2DM不良预后的AUC为0.782（95%CI：0.691～0.873），敏感度为75.8%，特异性为76.1%，截断值为46.62 U/L；联合分析AUC为0.836（95%CI：0.759～0.912），敏感度为84.8%，特异性为71.6%；二者联合检测并未显著提高对ARDS患者不良预后的诊断价值（P＞0.05），表5，图1。

图1 血清miR-92a、ACE表达水平对CHD合并T2DM患者不良预后的诊断价值ROC图

表5 血清miR-92a、ACE表达水平对CHD合并T2DM不良预后的诊断价值

2.5 Logistic回归分析CHD合并T2DM不良预后的危险因素将CHD合并T2DM患者是否发生预后不良作为因变量，以血清中TG、LDL-C、GLU、GHb、miR-92a、ACE表达水平作为水平自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示血清中miR-92a、ACE水平的升高是CHD合并T2DM不良预后的危险因素（P＜0.05），血清中TG、LDL-C、GLU、GHb为CHD合并T2DM患者预后不良的无关因素（P＞0.05），表6。

表6 CHD合并T2DM不良预后发生的多因素分析

3 讨论

T2DM是一种常见的慢性炎症和代谢类疾病，是诱发心血管疾病的危险因素之一，可通过葡萄糖毒性、脂肪毒性、炎症介质等途径损害心血管功能，其中较高比例的DM患者死于心血管疾病，资料显示冠心病（CHD）是T2DM主要并发症之一[9]。随着现代生活方式的改变，我国CHD合并T2DM患者越来越多，据不完全统计，我国目前有8000万人患CHD合并T2DM[10]。长期患CHD合并T2DM会造成重要脏器的功能性障碍，出现心动过速、胃轻瘫、膀胱排空困难、便秘、腹泻等一系列交替复发的临床症状，且病死率较高[11]。随着医疗科技手段的不断进步，关于CHD合并T2DM的临床治疗手段取得很大的进展，但是关于CHD合并T2DM不良预后的研究较少，因此寻找与CHD合并T2DM有关的生物学标志物对于CHD合并T2DM的病情及不良预后的诊断具有重要意义。

miRNA是一类进化保守的短序列小RNA，具有多种生物学功能，miR-92a在促进血管的生长及恢复损伤组织功能方面具有一定的调控作用，在冠心病等心血管疾病中发挥重要作用，研究发现miR-92a在稳定型CHD合并T2DM患者血清中呈现高表达[12,13]。ACE又称激肽酶，广泛存在于人体各组织中，与动脉粥样硬化CHD的发病机制密切相关，研究发现ACE在CHD、糖尿病等疾病中呈现高表达，推测二者可能对CHD疾病具有一定的预测及诊断价值[14,15]，探究血清中miR-92a、ACE表达水平对CHD合并T2DM不良预后的诊断价值具有重要意义，本研究结果显示，与对照组相比，CHD组及CHD合并T2DM组患者血清中miR-92a表达水平和ACE表达水平均显著升高，与相关研究一致，表明miR-92a和ACE表达水平与CHD及T2DM病情间存在一定联系，但二者与不良预后间的关系仍不清楚。

资料显示TG、LDL-C、GLU、GHb等指标能反应人体血脂、血糖代谢水平，研究发现在CHD合并T2DM病情恶化患者体内这些指标数值较高，可能与患者的病情具有一定的关系[16]，本研究结果显示，与预后良好组相比，预后不良组患者血清中TG、LDL-C、GLU、GHb、miR-92a表达水平和ACE表达水平均显著较高，提示血清miR-92a及ACE与CHD合并T2DM患者的血脂、血糖代谢水平密切相关，其水平异常升高可能预示不良预后的发生，可能与miR-92a、ACE对动脉粥样硬化疾病具有不利影响有关，miR-92a通过调控转录因子KLF2、血栓调节蛋白及一氧化氮合酶的表达发挥作用[13]，而ACE表达水平的增加会对心血管产生不利影响，主要通过促进血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ，引起醛固酮水平升高，进而引发动脉高压、心脏纤维化、心脏舒张功能障碍等不良症状[14,15]。ROC曲线及Logistic回归分析进一步说明，血清中miR-92a及ACE表达水平升高是CHD合并T2DM患者不良预后发生的危险因素，诊断CHD合并T2DM不良预后的敏感度和特异性较高，当CHD合并T2DM患者血清中miR-92a表达水平大于1.650，ACE值大于46.62 U/L时，患者发生不良预后的可能较大，需尽早采取措施预防不良事件的发生，此外二者联合检测并未显著提高对CHD合并T2DM患者不良预后的诊断价值。

综上所述，血清中miR-92a及ACE表达水平的升高与CHD合并T2DM的发病及不良预后联系密切，并对CHD合并T2DM不良预后具有一定的诊断价值。关于miR-92a及ACE在CHD合并T2DM中表达异常的具体机制尚不明确，需进一步研究。