利塞膦酸钠对去势大鼠骨折愈合的影响△

何立江，黄杰苗，吴俊哲，柯呈辉，吴文华

（福建医科大学附属第二医院脊柱骨科，福建泉州 362046）

随着我国逐渐步入老年化社会，老年性骨质疏松症及其并发症越来越受到重视。国外权威机构调查显示全球大约有2 亿人患有轻重不一的骨质疏松症，该病现已成为全球多发病、常见病的第6 位［1］。由于骨矿物质含量减少、骨骼强度降低和骨的脆性增加，患者极易发生骨折，具有极高的致残率和致死率，尽快提高患者骨密度和骨矿物质含量，促进骨折愈合避免出现二次骨折显得尤为重要，因此骨质疏松症性骨折的治疗已成为当今研究的热门课题［2，3］。

二膦酸盐类药物（bisphosphonates,BPs）是当前治疗骨质疏松的重要手段，也是近年来研究的热点，利塞膦酸钠是其中的代表药物，其主要通过抑制破骨细胞活性对骨骼代谢产生作用，虽有学者担心此类药物会影响骨的重建，进而对骨折的愈合过程造成影响［4］，但多数研究表明骨质疏松骨折术后应用该类药物可以提升患者骨折处的骨骼骨量，降低再骨折的发生率，可作为没有禁忌证的老年骨质疏松患者的首选药物［5］。

目前对于骨折术后应用二膦酸盐类药物的最佳时间尚无定论，因此本实验通过探讨术后不同时间应用利塞膦酸钠对去势骨质疏松模型大鼠股骨骨折愈合的影响，为临床应用二膦酸盐类药物时机选择提供相应的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

90 只健康6 个月龄雌性Sprague-Dawley （SD）大鼠，体重（232.07±16.25）g，由闽侯吴氏实验动物贸易有限公司提供。实验动物在中国人民解放军联勤保障部队第910 医院动物实验中心分组笼养，室温控制在（24±2）°C，专人喂养，自由饮水。实验前所有大鼠均适应性喂养1 周。实验过程中每周称重并记录，并按实验动物的3R 使用原则给予照护。随机分为3 组，每组30 只。

1.2 去势骨质疏松模型

大鼠按300 mg/kg 的10%水合氯醛腹腔内注射麻醉，由背侧入路，于脊柱旁开1 ㎝、髂骨脊上2 ㎝处为手术切口，切口长1 ㎝，分离肌层显露卵巢，切除卵巢并缝扎残端，逐层关闭切口。术后3 d 肌注青霉素80 万单位，2 次/d。卵巢切除术后第4 周，各组分别处死10 只，检测股骨骨密度确定制备骨质疏松动物模型成功，并测量骨折建模前股骨力学指标。

1.3 骨折模型建立与药物处理

卵巢切除去势手术4 周后，对3 组大鼠同样麻醉状态下，选取左股骨中段为手术切口，切口长1 cm，显露出股骨并截断股骨，以直径1.5 mm 钢针经髓腔固定断端，逐层缝合各层组织。严格无菌手术操作，术后3 d 肌注青霉素80 万单位，2 次/d。

3 组动物分别于骨折模型建立术后1 d、10 d 和20 d 开始给予利塞膦酸钠灌胃，0.1 mg/（kg·d），持续至处死动物。于骨折建模术后3 周和6 周，分别处死3 组各10 只动物，取出左侧股骨，行以下检测。

1.4 检测指标

1.4.1 骨矿检测

所有股骨标本置入双能X 线吸收仪，测量各标本骨密度值（bone mineral density,BMD）的变化。

1.4.2 影像学检查与测量

将处死后所有大鼠股骨标本于标准位拍摄X 线片，摄片参数41 kV，2.80 mAs，在PACS 系统分别观察骨折闭合间隙，测量断端骨皮质厚度，观察骨折愈合和内固定改变等情况。

1.4.3 组织学检查与评分

3 组各10 个股骨标本，经固定、脱钙、脱水、浸蜡制备蜡块，切制3 μm 的切片，行HE 染色。4×10 倍光镜视野下，计数软骨细胞数，观察骨痂处骨小梁、骨样组织等。

1.4.4 生物力学检查3 组各10 个股骨标本行力学测试。采用4 点弯曲力学检测方法，标本底端固定，固定支点跨距20 mm，顶端加压支点跨距8 mm，保持标本湿润状态下单轴侧向加压至标本断裂，加载速度1 mm/min，绘制载荷-位移曲线，记录股骨骨痂处最大抗折弯载荷。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量数据采用±s表示，资料呈正态分布时，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。资料呈非正态分布时，采用秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨矿检测结果

三组动物骨密度检测结果见表1。随时间推移，1 d 组BMD 均持续显著增加（P<0.05）；相比之下，10 d 组和20 d 组的BMD 呈曲线改变，骨折后3 周时下降至谷底，骨折后6 周时再次升高，不同时间点差异均有统计学意义（P<0.05）。骨折前，三组间的BMD 的差异无统计学意义（P>0.05），骨折3 周时，1 d 组和10 d 组BMD 差异无统计学意义（P>0.05），但两组均高于20 d 组（P<0.05）；骨折6 周时，BMD由高至低依次为：1 d 组>10 d 组>20 d 组，三组间差异均有统计学意义（P<0.05）。

表1 三组大鼠骨折前后骨密度检测结果（±s）与比较

表1 三组大鼠骨折前后骨密度检测结果（±s）与比较

指标BMD 值（g/cm2）P 值0.376<0.001<0.001时间点骨折前骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 组（n=10）0.119±0.007 0.124±0.006 0.280±0.030<0.001 10 d 组（n=10）0.122±0.005 0.119±0.004 0.213±0.020<0.001 20 d 组（n=10）0.121±0.004 0.114±0.006 0.123±0.005<0.001

2.2 影像和组织形态观察与计量

三组骨折后6 周典型影像改变见图1，可见1 d组内固定物无移位松动，骨折愈合良好（图1a）；10 d 组骨折愈合，骨痂生长良好（图1b）；20 d 组骨折处骨痂生长，但骨皮质较显单薄（图1c）。

图1 骨折后6 周三组大鼠股骨X 线检查所见 1a: 1 d 组骨折愈合良好 1b: 10 d 组骨折愈合，骨痂生长良好 1c: 20 d 组断端骨痂生长，但骨皮质较显单薄

三组骨折后6 周骨折端典型组织学改变见图2， 可见1 d 组的骨小梁较丰富，骨细胞数量多（图2a）；10 d 组骨小梁结构清晰，骨细胞数较多（图2b）；20 d 组骨小梁较稀疏，连续性较差，相比前两组骨细胞数目少（图2c）。

图2 骨折后6 周三组大鼠股骨骨折端组织学所见（HE，4×10） 2a: 1 d 组可见骨小梁较密集，骨细胞数量多 2b: 10 d组骨小梁连续性较好，骨细胞数较多 2c: 20 d 组骨小梁稀疏，连续性较差，骨细胞数目较少

两组形态计量结果见表2。与骨折后3 周相比，骨折后6 周时，3 组大鼠骨折端骨皮质厚度均有增厚，骨折后3 周、6 周时，1 d 组、10 d 组两组间骨皮质厚度差异无统计学意义（P>0.05），但两组骨皮质厚度较20d 组有显著增加（P<0.05）；此外与骨折后3 周相比，骨折后6 周时，3 组大鼠标本40 倍视野下骨细胞计数差异无统计学意义（P>0.05），3周、6 周时，1 d 组、10 d 组两组间细胞计数差异无统计学意义（P>0.05），但均较20 d 组有显著增加（P<0.05）。

表2 三组大鼠骨折端形态计量结果（±s）与比较

表2 三组大鼠骨折端形态计量结果（±s）与比较

指标影像测量骨皮质厚度（mm，n=10）骨折后3 周骨折后6 周P 值4×10 视野骨细胞计数（个，n=10）骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 组10 d 组20 d 组P 值<0.001 0.033 0.35±0.04 0.53±0.06<0.001 0.32±0.03 0.52±0.07<0.001 0.24±0.03 0.46±0.04<0.001<0.001 0.046 350.30±39.19 326.60±39.03 0.192 340.9±38.23 323.50±39.96 0.333 275.4±37.11 285.70±36.88 0.541

2.3 力学测试结果

三组力学测试结果见表3。随时间推移，三组股骨标本的最大载荷均显著下降（P<0.05）；骨折前，三组间最大载荷的差异无统计学意义，骨折后3 周、6 周，1 d 组、10 d 组间差异无统计学意义（P>0.05），10 d 组、20 d 组间差异无统计学意义（P>0.05），但1 d 组最大载荷高于20 d 组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表3 三组股骨标本最大载荷测量结果（N，±s）与比较

表3 三组股骨标本最大载荷测量结果（N，±s）与比较

时间点骨折前骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 组（n=5）38.10±3.51 34.10±3.51 26.10±4.15<0.001 10 d 组（n=5）37.60±3.47 31.90±3.41 23.10±3.73<0.001 20 d 组（n=5）38.70±3.30 30.10±3.03 21.50±3.17<0.001 P 值0.774 0.040 0.031

3 讨 论

本次实验三组大鼠均实现骨折愈合，表明在骨转换中利塞膦酸钠对成骨细胞活性未造成明显干扰，不会造成骨折不愈合的不利影响，这与其他学者的观点是相似的［6，7］。骨折术后第3 周时，1 d、10 d 两组大鼠骨密度含量均高于尚且未使用利塞膦酸钠的20 d 组，表明在骨折愈合早期利塞膦酸钠有助于快速提升骨密度，其机理可能主要通过对破骨细胞直接发挥细胞毒性作用、干扰成熟破骨细胞的功能等方面发挥作用［8］。1 d、10 d 两组大鼠分别相差10 d 后应用利塞膦酸钠，但具有相近的中短期疗效，考虑为利塞膦酸钠起效较快，短时间内即能有效提高骨密度，故早期和偏早期使用该药物具有较近似的效果，有对比研究亦表明利塞膦酸钠能缩短骨质疏松患者的骨折愈合时间［9］。

在骨折术后第6 周时，三组大鼠均实现股骨骨折愈合，未发生内固定松动和再骨折，相比其他种类抗骨质疏松药物具有较高的安全性［10］。但X 线影像显示1 d、10 d 两组大鼠骨折愈合处的骨痂总体来说相对更加厚实，骨皮质也更显粗厚，骨小梁数量较高也较密集，骨小梁相互之间连续性更好。病理切片显示出相类似的结果。实验发现，分别从骨折早期和偏早期开始应用利塞膦酸钠，在骨折愈合过程的中期时，其增加骨密度的效果是相近的，但在骨折愈合晚期则表现出不同的疗效，数据显示三组大鼠股骨骨密度远期疗效指标间亦存在差异，较早使用利塞膦酸钠也能更大程度提升骨折愈合时股骨最大载荷值等生物力学指标。从另一个角度思考，是否利塞膦酸钠在骨折愈合后期的作用随着时间的推移而效果逐渐降低？结合本实验，作者认为利塞膦酸钠对骨密度的提升趋势是具有一定程度的时间依赖性的，即随着时间的进展其提升趋势逐渐放缓。

做为具有较强药物活性的二膦酸盐类药物，利塞膦酸钠在本次骨质疏松骨折术后不同时间点的应用研究中，并未对实验动物造成骨折不愈合的不利影响，而且尽早应用二膦酸盐类药物能够更快促进骨折处钙盐的沉积，增加骨密度改善骨质量，增强骨折愈合强度，能够达到预防内固定松动和二次骨折发生的作用。当然本实验也存在不足之处：首先本实验设计样本不够大，未能更细分时间点来对骨愈合指标的提升曲线变化做更细致的相关性分析，其次，鉴于有报道长时间使用二膦酸盐类药物会增加非典型性股骨骨折风险［11］，因此对该类药物的安全有效用药时间及对骨折愈合的远期效果，需要更长时间跨度的进一步研究。