斑马鱼血栓模型在中药活性成分筛选中的适用性

莫彩莲，李杰，王加珍，刘鑫，林圣华，牟艳玲， 张云，刘可春*，何秋霞*

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院) 山东省科学院生物研究所 山东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选工程技术研究中心， 山东 济南 250014; 2.山东第一医科大学(山东省医学科学院) 药物研究所，山东 济南 250062)

血栓性疾病具有高发病率、高致残率和高致死率，严重威胁着人类的健康[1]。在血栓性疾病的研究过程中，已经建立了许多动物血栓模型。兔、犬、猫、小型猪动物血栓模型存在实验成本高、饲养空间占有率大、对动物创伤大和术后管理困难等问题，易导致非血栓性死亡。大鼠、小鼠动物血栓模型由于其体型较小，操作技术要求高，且在建造某些血栓模型中血栓形成率低，不稳定，存在形成的血栓易溶栓等问题。传统的动物血栓模型虽然已经研究多年，但诱导形成的动物血栓模型与人类病理性血栓还存在很多差异。因此建立与临床病理生理机制相似的血栓模型对于抗栓药物的研究是十分必要的[2]。

斑马鱼(Daniorerio)因其胚胎小、水生环境和小分子渗透性强等特点，成为一个备受青睐的用于高通量药物筛选的模式动物。与线虫、果蝇、鼠等其他模式生物相比，斑马鱼与人器官在结构、生理、分子水平等方面惊人地相似，和人类的基因组保守性很高，基因组同源性87%。在蛋白质水平上，关键部位的同源性几乎是100%。斑马鱼血液对凝血剂(如胶原和ADP)和抗凝血剂(如阿司匹林和杀鼠灵warfarin)的反应与人类血液相似，在人类血栓症中起重要作用的几个基因已经通过序列同源性在斑马鱼中找到[3-5]。国内外利用斑马鱼以及其突变体已建立了多种人类疾病模型，如抗新生血管形成、肿瘤、血液疾病、细胞凋亡和增殖、脂质代谢、炎症和中枢耐受等[6-7]，并开展了相关的药物筛选评价研究工作。

在血栓形成过程中起核心作用的是血小板的活化。血小板是一种多功能细胞，具有黏附、聚集和释放功能，并且有较强的促凝活性，在血栓形成与止血过程中起重要作用。许多血栓性疾病都有血小板聚集释放功能亢进，微循环血小板聚集增多现象。抑制血小板聚集性的异常发生，对心脑血管性疾病及其他血栓栓塞性疾病的防治都有重要的意义[8]。我国拥有极为丰富的中药材资源，从天然产物中发现结构新颖、活性独特的先导化合物已经成为新药研究的一个重要途径。本研究在建立斑马鱼血栓模型中，选择20种中药成分单体，分别利用斑马鱼模型和血小板模型检测其对血小板聚集的影响，研究了斑马鱼模型在中药成分活性评价中的适用性。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

中药对照品葛根素(批号20051322，质量分数99%)、甘草次酸(批号18121241，质量分数98%)、银杏内酯A(批号19062716，质量分数99%)、银杏内酯B(批号19032631，质量分数99%)、桃叶珊瑚苷(批号19010241，质量分数98%)、姜黄素(批号19072423，质量分数98%)、苦参碱(批号19072636，质量分数98%)、金丝桃苷(批号19062525，质量分数98%)、红景天苷(批号20070222、质量分数98%)、绿原酸(批号20031535，质量分数98%)、虎杖苷(批号19080241，质量分数99%)、甘草苷(批号19041032，质量分数98%)、莽草酸(批号19071935，质量分数98%)、银杏内酯C(批号19112641，质量分数99%)、黄芪甲苷(批号19091023，质量分数98%)、芍药苷(批号19071131，质量分数98%)、大豆苷元(批号20022611，质量分数99%)、大豆苷(批号20040906，质量分数99%)、防己诺林碱(批号20070344，质量分数97%)、盐酸黄连碱(批号19042341，质量分数98%)，均购自上海同田生物技术股份有限公司；低分子肝素购自Sigma公司；二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)购自上海生工生物工程服务有限公司；三氯化铁购自天津化学试剂厂。

1.2 仪器

COIC-ZSA302 型体视显微镜；X51 型倒置显微镜；SZX16 型体视荧光显微镜(日本Olympus公司)；PACKS-4 型血小板聚集仪(美国Helena公司)。

1.3 动物

野生型AB 系斑马鱼和TG系( integrin αIIb∶EGFP)血小板标记绿色荧光转基因斑马鱼均由本实验室提供；清洁级SD雄性大鼠，体重(250±20)g，山东省中医药大学实验动物中心提供，许可证号SCXK-(鲁)-2019-0001。

2 方法

2.1 斑马鱼胚胎收集

2.2 样品溶液配制

2.2.1 中药对照品

称取中药对照品，溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中获得100 mg/mL 样品储存液，再用胚胎培养用水稀释至不同质量浓度，并保证筛选体系中DMSO 体积分数不高于 0.5%[9]。

2.2.2 三氯化铁

用纯净水配成100 mg/L储存液，用斑马鱼胚胎培养用水稀释成不同浓度的三氯化铁应用溶液。

2.3 中药对照品处理方法

斑马鱼受精发育天数(days post fertilization，dpf)为4 d时，在体视倒置显微镜下挑选发育正常的斑马鱼仔鱼，移入24 孔板的样孔中，每孔5条。样孔中已预先加入新配好的中药对照品溶液 (10、20、40 μg/mL)，对照组为胚胎培养用水，随后加盖封闭，置于光照培养箱(28 ℃)内，让胚胎继续发育。

2.4 血栓形成检测

斑马鱼血栓细胞在3 dpf开始进入循环系统，到5 dpf发育成熟。4 dpf斑马鱼仔鱼经受试药品孵育24 h后，向各组加入2×10-6mol/L的三氯化铁，并开始计时，在荧光显微镜下观察TG荧光斑马鱼肠下腹主动脉血小板凝集，在倒置显微镜下观察记录肠下腹主动脉血管阻塞时间。

2.5 血小板血浆制备

2.6 抗血小板聚集体外实验

将中药单体按终浓度的10倍配制后，取20 μL 溶液加入含PRP 180 μL 管中，置于37 ℃ 孵育2 min。由PPP 调零后，用微量进液器在不同比色杯中加入20 μL二磷酸腺苷(ADP)，按比浊法[11]用血液聚集仪记录5 min内的聚集曲线，用聚集曲线面积来表示体外血小板的最大聚集率，并计算中药单体抑制血小板聚集的聚集抑制率。聚集抑制率=(对照管最大聚集率-实验管最大聚集率)÷对照管最大聚集率×100%。

2.7 统计分析

采用SPSS13.0统计软件对所有数据进行统计分析，对照组与加药组之间的比较用One-Way ANOVA分析，数据均以x±s表示。

3 结果与分析

3.1 中药材单体成分对斑马鱼血栓形成的影响

以5 dpf斑马鱼仔鱼为模型，以三氯化铁为血栓形成诱导剂，对20种中药材单体成分进行了抗血栓形成活性检测，结果显示其中7种中药材具有抑制血栓形成活性。桃叶珊瑚苷10 μg/mL具有明显的抑制斑马鱼血栓形成作用，40 μg/mL处理组的血流时间超过了2 h。在银杏内酯B 20 μg/mL和40 μg/mL处理组，三氯化铁诱导后的血流时间分别为(51.7±8.3)min和(69.5±9.7)min。黄芪甲苷、芍药苷、甘草次酸、银杏内酯A和葛根素也表现出了不同程度的血栓形成抑制作用(表1)。

表1 中药材单体成分对斑马鱼血栓形成的抑制作用(x ± s，n=30)

3.2 中药单体成分对血小板体外聚集的影响

以离体血小板为模型，对上述20种中药材成分进行了血小板聚集实验，结果显示12种中药材成分具有抑制血小板聚集的作用，其中100 μg/mL 红景天苷的血小板聚集抑制率为88.22%，100 μg/mL苦参碱抑制率为64.54%，25 μg/mL银杏内酯B抑制率为30.70%，50 μg/mL黄芪甲苷抑制率为53.91%，25 μg/mL 桃叶珊瑚苷抑制率39.71%，100 μg/mL 金丝桃苷抑制率为88.68%，50 μg/mL 芍药苷抑制率为26.77%，50 μg/mL 大豆苷元抑制率为27.14%，50 μg/mL甘草次酸抑制率为59.57%，50 μg/mL 大豆苷抑制率为30.83%，50 μg/mL银杏内酯A抑制率为30.23%，25 μg/mL 葛根素抑制率为64.31%(表2)。

表2 中药材单体成分对血小板聚集的影响(n=10)

基于斑马鱼模型抗血栓实验和体外抗血小板聚集的实验结果，我们查阅文献发现(表3)，姜黄素[12]没有体外血小板抗凝作用。与本研究结果一致。绿原酸[13]、甘草苷[14]、莽草酸[15]和银杏内酯C[16]、甘草次酸[17]、银杏内酯A[18]、桃叶珊瑚苷[19]对体外血小板聚集有抑制作用；虎杖苷[20]、苦参碱[21]和葛根素[22]可以抑制血小板聚集和微血栓的形成；银杏内酯B[23]、金丝桃苷[24-25]和红景天苷[26]已被证实具有体外抗血小板凝聚活性和体内抗血栓作用；芍药苷[27]、黄芪甲苷[28]、大豆苷元和大豆苷[29]等单体中药成分，未见在其他动物血栓模型上具有活性作用的单独文献报道，但都作为某些有效抗血栓药物或抑制血小板聚集药物成分一并报道过。本研究实验结果与已有文献报道结果基本一致，但某些中药单体成分抗血栓形成活性不一致，其可能原因是采取的中药成分单体用量以及采用的实验方法不同所致。

表3 中药材单体成分抗血栓形成活性对比表

续表3

4 结语

本研究利用斑马鱼血栓模型，对多种中药活性单体成分同时进行抗血栓活性检测，较其他传统动物血栓模型用药微量、高效，能够高通量筛选抗栓活性成分。筛选出的活性成分通过血小板体外聚集实验验证以及查阅文献比对，说明斑马鱼血栓模型对抗栓药物的筛选有很好的适用性，这为发现抗血栓中药活性单体提供了一个研究思路，为制造抗血栓药物提供了可行的研究切入点。

下一步工作可以结合已报道的文献，对筛选出的抗血栓中药活性单体进行作用机制探索。