仿生提取电感耦合等离子体－质谱法同时测定小儿惊风七厘散中可溶性有害元素含量

张 晶，祖全花，李智敬，隋鲁英

（山东省德州市中医院，山东 德州 253013）

小儿惊风七厘散由牛黄、麝香、雄黄、天竺黄、琥珀、朱砂等33 味药材组方，有清热解毒、祛风化痰、解热镇惊功效，主要用于治疗小儿外感风邪所致上呼吸道感染、肺炎、痢疾肠炎、积滞等症［1－2］，目前执行的标准为《卫生部药品标准·中药成方制剂（第十一册）》［3］。方中，朱砂镇惊安神、清心明目［4－5］，主要成分为硫化汞（HgS），还有少量的游离汞和可溶性汞盐，如氯化汞和氧化汞等［6］；雄黄解毒杀虫、抗惊痫［7－8］。二者合用药效作用一致，但朱砂和雄黄均含有对人体有害的汞盐和砷盐，长期服用会损坏小动脉和血管壁，同时对人体各个器官及中枢神经系统和生殖系统造成慢性中毒［9－12］。该药又主要用于儿科，小儿的器官未发育完全，用药风险增大。目前，可溶性汞盐和砷盐主要由于朱砂和雄黄的不恰当炮制所致，同时含有其他重金属。小儿惊风七厘散现行标准中的朱砂和雄黄药材主要通过显微鉴别控制，未对其进行定量控制。重金属的定量测定主要有原子吸收光谱法、原子荧光法，电感耦合等离子体－质谱法（ICP －MS）法等。本研究中参考文献［13－16］和《中国药典》［17］建立了同时测定小儿惊风七厘散中5 种可溶性有害元素含量的仿生提取ICP－MS 法，可为其临床安全用药提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo ICAP－Q series 型电感耦合等离子体质谱仪（美国赛默飞公司），配有半导体制冷雾化器，镍采样锥，截取锥，TOPEX 全能型化学工作站；SHA － B 型恒温水浴振荡器（常州金坛友联仪器研究所）；XE204T型电子分析天平（梅特勒仪器有限公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

汞（Hg）单元素标准物质［批号为 GBW（E）081593，质量浓度为 1 000 μg ／mL］，砷（As）单元素标准物质（批号为 GBW08611 －15105，质量浓度为 1 000 μg／mL），铅（Pb）单元素标准物质［批号为 GBW（E）081577，质量浓度为 1 000 μg ／mL，镉（Cd）单元素标准物质［批号为GBW（E）081581，质量浓度为 1 000 μg／mL，铜（Cu）单元素标准物质［批号为 GBW（E）081579，质量浓度为1 000 μg ／mL］，金（Au）单元素标准溶液（批号为 GNM －SAU －002－2013，质量浓度为 100 μg／mL），内标溶液铋（Bi，批号为 GSB 04－1719－2004）、锗（Ge，批号为GSB 04－1728－2004）、钪（Sc，批号为 GSB 04－1760－2004）、铟（In，批号为 GSB 04－1731－2004），质量浓度均为1 000 μg／mL，均购自国家计量科学研究院；STD调谐液为仪器自带；盐酸为优级纯；胃蛋白酶（上海国药化学试剂有限公司）；水为超纯水，由Mili－Q 型超纯水机（电阻率≥18.2 MΩ·cm，美国 Millipore 公司）制得；液氮为高纯液氮；小儿惊风七里散（云南腾药制药股份有限公司，批号分别为 20171106，20181101，20181202，规格为每粒 0.2 g）。

2 方法与结果

2.1 ICP － MS 条件

采用STD 模式下用调谐液调整仪器各项参数，使元素丰度、氧化物产率、双电核离子产率等指标达到测定要求（仪器主要工作参数见表1）。测定时选取的同位素为75As 和202Hg，并以72Ge 和209Bi 作为内标物质进行校正，依次分别将空白试剂、系列标准溶液、样品溶液上机测定，重复测定3 次。分别引入仪器，采集数据，绘制标准曲线，计算回归方程。

表1 ICP－MS 主要工作参数Tab.1 Working parameter of ICP －MS

2.2 溶液制备

分别精密吸取上述5 种元素的单元素标准溶液各适量，加超纯水，分别稀释成每1 mL 中分别含Pb 5，10，20，30，40 ng，Cd 0.2，0.5，1，2，8 ng，Cu 50，100，200，400，600 ng，As 1，2，4，8，16 ng，Hg 0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 ng 的系列混合标准溶液。

分别精密量取上述内标元素多元素标准溶液（质量浓度为 1 000 μg ／mL），用超纯水稀释成每 1 mL 含 Bi，Ge，Sc，In 各 0.1 μg ／mL 的对照品混合溶液。

分别精密量取Au 元素标准溶液，用超纯水稀释成每 1 mL 含 Au 元素 1 μg 的溶液，作为稳定剂。

取稀盐酸16.4 mL，加水800 mL 与胃蛋白酶10 g，摇匀，加水稀释成 1 000 mL，即得人工胃液［17］。

取样品（批号为 20171106）0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入人工胃液50 mL，于37 ℃恒温振荡器中振荡 4 h，频率为 150 r／min，取出，离心（4 000 r／min）10 min，吸取上清液，即得供试品溶液。同时，取相同体积的人工胃液作为空白溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取2.2 项下5 种元素的系列混合标准溶液，按2.1 项下仪器工作条件进样分析测定，内标进样管插入质量浓度为0.1 μg／mL 的内标溶液中，同时按从低到高的浓度依次将进样管插入上述5 种元素的系列混合标准溶液中，以仪器3 次信号值的平均值为纵坐标（Y）、相应进样质量浓度为横坐标（X，ng／mL），进行线性回归。结果见表2。

表2 5 种元素的线性方程、相关系数和线性范围（n ＝3）Tab.2 The linear equation，correlation coefficient and linear ranges of five soluble harmful elements（n ＝ 3）

精密度试验：取2.2 项下5 种元素系列混合标准溶液，分别取5 种元素的低、中、高浓度的系列混合标准溶液，按2.1 项下仪器工作条件进样测定，每个浓度重复测定6 次，记录测量信号值。结果Pb 的 RSD 分别为2.02% ，1.53% ，0.98% （ n ＝ 6）；Cd 的 RSD 分 别 为3.17% ，2.28% ，1.02% （ n ＝ 6）；Cu 的 RSD 分 别 为1.01% ，0.79% ，0.62% （ n ＝ 6）；Hg 的 RSD 分 别 为4.16% ，2.08% ，1.22% （ n ＝ 6）；As 的 RSD 分 别 为2.97% ，2.01% ，1.58% （ n ＝ 6）。RSD 均在 5% 以内，表明该仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20171106）样品0.2g，精密称定，按2.2 项下方法平行制备供试品溶液6 份，按2.1 项下仪器条件进样测定，每份样品重复测定3 次，求平均值，分别计算5 种元素的含量。结果 Pb，Cd，Cu，Hg，As 的平均含量分别为 1.203 2，0.081 9，5.063 8，0.102 1，0.851 8 mg ／kg，RSD 分别为 1.67% ，2.08% ，1.05% ，2.17% ，1.26% （n ＝ 6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20171106）样品0.2g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下仪器条件分别于 0，1，2，4，8，16，24 h 时进样测定，记录测定值。结果 Pb，Cd，Cu，Hg，As 的 RSD 分别为1.85% ，1.67% ，2.09% ，2.52% ，2.68% （n ＝7），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

加样回收试验：精密吸取上述5 种元素标准溶液各适量，用水稀释成每1 mL 分别含Pb 100 ng、Cd 10 ng、Cu 500 ng、Hg 10 ng、As 100 ng 的混合溶液，作为待加标准溶液；然后取同一批（批号为20171106）样品0.1 g，精密称定，平行6 份，置具塞三角锥形瓶中，分别精密吸取上述待加标准溶液各1 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下仪器条件进样测定。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n ＝6）Tab.3 Results of the recovery tests（n ＝ 6）

2.4 样品含量测定

分别取不同批号（批号分别为 20171106，20181101，20181202）样品，按 2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下仪器条件进样测定，采用标准曲线法分别计算样品中可溶性Hg 和As 的含量，并根据药品的每日最大使用量，计算每日摄入人体Hg 和As 的总量。结果见表4。

表4 3 批样品中可溶性有害元素含量测定结果Tab.4 Content determination of five soluble harmful elements in the three batches of samples

3 讨论

3.1 供试品制备方法

小儿惊风七厘散中的朱砂和雄黄均经水飞后入药，朱砂和雄黄药材多采用机械化（球磨机）干法研磨，不仅会使Hg 和As 游离出来，同时也不能除去可溶性汞盐和砷盐及其他类重金属，这是导致朱砂和雄黄中毒的主要原因。本研究中为了更好地模拟可溶性汞盐和砷盐在人体的溶解性，采用仿生提取，即人工胃液进行萃取，采用ICP－MS 法进行测定。同时考察了供试品的提取时间，分别于 2，4，8，12，16 h 时进样测定。结果随着时间的增长，样品中可溶性有害元素的含量依次增大；提取时间超过4 h 后，可溶性Hg 和As 的含量变化不大。综合考虑人体实际服药时间，选择供试品的提取时间为4 h。

3.2 可溶性有害元素测定

小儿惊风七厘散中含有朱砂和雄黄，若直接采用微波消解，再测定Hg 和As 的含量，二者均会超过药典规定的限度（Hg≤0.2 mg ／kg，As≤2 mg ／kg）。并非所有的Hg 和As 都具有毒性，其毒性与其所处的价态有较大关系，且微波消解也不符合人体对其吸收的条件。本研究中采用模拟人工胃液进行提取，测定5 种可溶性有害元素的含量，控制其安全性。同时发现，Hg 极易附着在仪器的采样锥和矩管上，影响As 的测定，因此在测定样品时需加入一定量的Au 元素标准溶液作为稳定剂，以消除Hg 元素的记忆效应，减少对As 元素测定的干扰，保证测定结果的准确性，测定完成后要充分冲洗，尽量减少Hg 在仪器中的残留污染。

3.3 安全性评价

朱砂的毒性主要源自可溶性汞盐，其与蛋白质的巯基结合能力较强，可与血液中的血红蛋白结合而进入人体各器官，损害组织器官；雄黄的主要剧毒成分为As2O3，与其炮制方法和生产工艺有关。因此，要对可溶性的有害元素，尤其是汞盐和砷盐进行控制。根据中药有害残留物限量指导原则及该药的每日允许最大使用量，参照《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》规定的限度，Pb≤5 mg／kg，Cd≤0.3 mg／kg，Cu≤20 mg ／kg，Hg≤0.2 mg ／kg，As≤20 mg／kg。结果小儿惊风七厘散中5 种可溶性有害元素的含量均未超标，表明服用该药是安全的，但因小儿的器官未发育完全，为了减少不必要的伤害，应尽量少服用或不服用含朱砂和雄黄的中成药。

3.4 ICP － MS 的优点

ICP－MS 是目前公认的测定痕量元素的分析仪器，可同时测定多种元素，灵敏度和准确性均较高，能避免逐个分析原子吸收，分析速度快，极大地缩短了试验时间，提高试验效率。但分析质量数较小的元素时极易受质谱干扰，为提高灵敏度，需减少元素相互间的干扰，补偿基质效应。依据“质量数相近，电离电位相近”的原则，选择208Pb 和202Hg 以209Bi 作内标物，114Cd 以115In 作内标物，63Cu 以47Sc 作内标物，75As 以73Ge 作内标物，减少了元素间的直接干扰。同时，长时间测定后要清洗雾化器和采样锥，防止污染，试验所用容量瓶和大肚吸管均为聚乙烯塑料材质，均应采用20%硝酸浸泡过夜洗净后使用，以保证结果的准确性。