山奈酚减轻人角质形成细胞氧化应激损伤

邹雪莲，胡 雯，雷子贤，王红娟，徐 晨，哈丽娜·海若拉，康晓静*

(1.安徽医科大学 新疆临床学院，新疆 乌鲁木齐830001；2.新疆维吾尔自治区人民医院 皮肤性病科，新疆 乌鲁木齐830001；3.新疆维吾尔自治区科技厅 新疆皮肤病研究重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830001)

白癜风是一种常见的获得性色素脱失性疾病，氧化应激导致功能性黑素细胞破坏是其发病的关键环节[1]。除黑素细胞外，角质形成细胞在白癜风的发生发展中同样发挥了重要作用[2-3]。核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)靶向细胞抗氧化损伤的相关基因，研究表明其参与白癜风发病的黑素细胞Nrf2活化缺陷[4]。驱虫斑鸠菊(Vernoniaanthelmintica(L.)Willd.)是新疆治疗白癜风的传统特色药物。上世纪70年代，驱虫斑鸠菊针剂已用于治疗白癜风，临床疗效显著[5]。其化学成分复杂，目前普遍认为黄酮类化合物是发挥治疗作用的主要成分。山奈酚(Kaempferol，KP)作为最常见的天然黄酮类化合物，广泛存在于绿叶蔬菜及韭菜和龙蒿等草本植物中，具有抗氧化、抗癌、抗感染、抗菌等功能[6]。本研究拟探索KP对HaCaT细胞内Nrf2及其下游抗氧化基因的表达影响，明确驱虫斑鸠菊的抗氧化作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

驱虫斑鸠菊(新疆乌鲁木齐市埃力克维吾尔医大药房)由新疆维吾尔自治区药物研究所鉴定为菊科植物驱虫斑鸠菊Vernoniaanthelmintica(L.)Willd.的种子。各黄酮类化合物标准品(Sigma-Aldrich和Steraloids公司)；人永生化角质形成细胞系(human immortalized keratinocytes，HaCaT)(中国科学院昆明细胞库)；山奈酚(kaempferol，KP，分子式：C15H10O6)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐[2,2-azobis (2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH，分子式：C8H18N6·2(HCl)](北京索莱宝科技有限公司)；反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；RT-qPCR试剂盒(Qiagen公司)；Nrf2抗体(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 驱虫斑鸠菊种子总黄酮含量测定及黄酮类物质定量：用60%乙醇溶液对适量混匀的样品进行两次超声提取，滤液并于容量瓶中，即为供试品。取2.0 mL供试品于比色管中，用60%乙醇补充至5.0 mL，依次加入50 g/L亚硝酸钠、100 g/L硝酸铝及200 g/L氢氧化钠后，用60%乙醇定容，摇匀，放置15 min。用1 cm比色皿以相应的不添加100 g/L硝酸铝的试样液作为空白进行校正，在波长510 nm处测定吸光度值。根据公式计算样品中总黄酮含量。取适量供试品于离心管中，离心后取上清，液质联用分析用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统，多反应监测技术质谱分析用Sciex 5500 QTRAP质谱仪，黄酮类物质定量用Analyst软件。

1.2.2 细胞的分组及处理：将HaCaT细胞分为对照组，AAPH模型组，低、中、高剂量KP干预组。3～5代细胞用于实验，用含1%双抗、10%胎牛血清的高糖DMEM培养基对HaCaT细胞进行常规培养，细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中，每2天更换1次培养液，光学显微镜下持续观察细胞，待细胞汇合度为80%～90%且状态良好时，用胰蛋白酶消化传代，进行后续实验。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖：按照每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板中，每孔内加1×103个细胞，设置不同浓度梯度的AAPH(以一定质量粉末直接溶于完全培养基中配制而成)或山奈酚，并设立空白对照，每组5个复孔，置于细胞培养箱中继续培养一定时间后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，在酶标仪450 nm处测定吸光度值，计算细胞增殖率。实验至少重复3次。

1.2.4 不同浓度山奈酚对HaCaT细胞形态的影响：调整细胞为5×105个/mL，以每孔2 mL接种于6孔板中，经不同浓度KP(10、20、30 μmol/L)及AAPH处理后，用倒置相差显微镜观察各组的HaCaT细胞形态学变化。

1.2.5 RT-qPCR检测细胞中Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC和GCLM mRNA水平：常规提取细胞总RNA，反转录为cDNA后进行RT-qPCR检测。引物设计及合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，Nrf2上游引物：5′-TCCAAGTCCAGAAGCCAA ACTGAC-3′，下游引物：5′-GGAGAGGATGCTGCTG AAGGAATC-3′；血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)上游引物：5′-TGCCAGTGCCACCAAGTTCA AG-3′，下游引物：5′-TGTTGAGCAGGAACGCAGTCT TG-3′；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO1]上游引物：5′-GTCGGCAGAAGAGCACTGATCG-3′，下游引物：5′-ACTCCACCACCTCCCATCCTTTC-3′；谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)上游引物：5′-CT TTCTCCCCAGACAGGACC-3′，下游引物：5′-CAAGG ACGTTCTCAAGTGGG-3′；谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit，GCLM)上游引物：5′-TGCTGTGTGATGCCACCAGA TTTG-3′，下游引物：5′-GTGCGCTTGAATGTCAGG AATGC-3′；内参GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGA TCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTC ATACTTCTCATGG-3′。

1.2.6 Western blot检测Nrf2蛋白表达：收集各组细胞，以RIPA裂解液裂解并提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白含量后，95 ℃蛋白变性10 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Nrf2一抗(1∶2 000)4 ℃孵育过夜，次日二抗(1∶10 000)室温孵育1 h，增强化学发光法(ECL)显色并拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 驱虫斑鸠菊种子代谢物标准品XIC图

黄酮类物质标准品的XIC图显示各代谢物的色谱分离较好，峰形尖锐对称，相关系数均大于0.99，能够对各代谢物进行质谱定量。

2.2 驱虫斑鸠菊类黄酮物质定量结果

通过乙醇萃取法测定驱虫斑鸠菊种子总黄酮类物质含量为0.97 g/100 g。定量分析共获得36种合类黄酮化合物，其中异黄酮和黄酮苷类各9种，黄烷类7种，黄酮类5种，O-甲基化类黄酮查尔酮和羟基肉桂酸各2种，二氢查尔酮类和黄烷酮类各1种。以黄烷类化物圣草酚含量最高，为12 651 ng/100 g。KP含量为63 ng/100 g。保留时间最短的为黄烷类化合物(-)-表没食子儿茶素，保留时间为2.76 min；最长的为异黄酮化合物葛根素，保留时间为10.81 min。KP保留时间为9.07 min。驱虫斑鸠菊种子主要黄酮类物质定量结果见表1。

表1 驱虫斑鸠菊种子中主要黄酮类物质含量Table 1 Contents of main flavonoids in the seeds of Vernonia anthelmintica (L.)Willd.

2.3 CCK-8法检测AAPH和KP对HaCaT细胞增殖的影响

AAPH呈剂量依赖性抑制细胞增殖(P<0.001)，选择25 mmol/L作为本实验的造模浓度，此时细胞存活率为(62.33±4.98)%(图1A)。KP浓度为0～40 μmol/L时，未见明显细胞毒性。安全剂量的KP可减轻AAPH导致的细胞损伤，随着山奈酚浓度的升高，HaCaT细胞存活率逐渐恢复(P<0.05)(图1C)。故后续实验选择10、20、30 μmol/L为KP低、中、高剂量组(细胞存活率分别为77.86%±0.79%、84.01%±2.80%和89.42%±3.01%)(图1)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with model group图1 CCK-8检测AAPH和KP对HaCaT细胞增殖的影响Fig 1 CCK-8 detection of the effects of AAPH and KP on the proliferation of HaCaT cells

2.4 不同浓度KP对HaCaT细胞形态学的影响

对照组细胞形态近似梭形或多角形，边缘清晰，树突多。模型组细胞形态略偏椭圆形或圆形，边缘模糊，贴壁细胞数量减少。不同浓度的KP干预HaCaT细胞后，细胞形态在一定程度上得到恢复(图2)。

A-E.control group;model group;low-,medium-,high-dose KP intervention groups图2 不同浓度KP对HaCaT细胞的形态学影响Fig 2 Effects of different concentrations of KP on morphology of HaCaT cells (×100)

2.5 KP对HaCaT细胞内Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC及GCLM mRNA表达的影响

与对照组相比，25 mmol/L AAPH可增加细胞内Nrf2、HO-1、GCLC和GCLM mRNA的表达水平；与模型组相比，低剂量KP可增加HaCaT细胞内Nrf2、HO-1和GCLC mRNA表达水平，高剂量KP仅增加细胞内Nrf2 mRNA表达水平。其中低剂量KP对HO-1的影响最为显著，表达增量为对照组的48倍、模型组的4倍(图3)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model图3 KP对HaCaT细胞Nrf2、HO-1、NQO1、GCLC及GCLM mRNA表达的影响Fig 3 Effects of KP on the expression of Nrf2,HO-1,NQO1,GCLC and GCLM mRNA in HaCaT cells

2.6 KP对HaCaT细胞内Nrf2蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组HaCaT细胞内Nrf2蛋白表达增加(P<0.05)。与模型组相比，不同剂量KP可呈浓度依赖性增加细胞内Nrf2蛋白表达(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with model图4 KP对HaCaT细胞Nrf2蛋白表达的影响Fig 4 Effect of KP on the expression of Nrf2 protein in HaCaT cells

3 讨论

驱虫斑鸠菊为菊科Compositae斑鸠菊属一年生草本植物，目前对这一传统药物的研究多局限在总黄酮提取层面，黄酮类单体的研究相对较少。本实验测定驱虫斑鸠菊种子总黄酮类物质含量为0.97 g/100 g，共获得36种黄酮类化合物，是目前国内对驱虫斑鸠菊种子中黄酮类物质种类鉴定最多的一次报道。KP是驱虫斑鸠菊黄酮类化合物中生物利用度最高的一种单体，可显著增加黑素合成基因的表达并提高酪氨酸酶活性[7]，提示KP是驱虫斑鸠菊发挥治疗作用的一种有效成分。本实验明确KP在驱虫斑鸠菊种子中的定量，为62.96 ng/100 g。AAPH是可靠的氧化应激造模药物，其与HaCaT细胞共同构建的体外氧化应激模型更加经济有效且易于重现，适用于多种氧化应激相关皮肤疾病的病理研究[8]。本实验以AAPH刺激HaCaT细胞模拟白癜风体外氧化应激，用不同浓度KP对细胞进行预处理，结果表明KP可以保护HaCaT细胞对抗AAPH诱导的细胞损伤。

Nrf2是保护细胞免受氧化损伤的关键转录因子[9]。氧化应激时，Nrf2与伴侣蛋白解偶联并快速转移入核，与细胞内的抗氧化反应元件结合，启动下游抗氧化基因的表达，提高细胞对氧化损伤的抵抗性。这些基因主要包括HO-1、NQO1、GCLC与GCLM。其中HO-1的上调可极大提高细胞对氧化损伤的保护作用[10-11]。健康人黑素细胞的体外氧化应激模型中Nrf2及下游抗氧化基因的mRNA和蛋白表达增加[12-13]。本实验在HaCaT细胞的体外氧化应激模型中得到了同样的结果。KP在体外具有极强的抗氧化活性，可直接清除活性氧簇，激活Nrf2/HO-1通路[14]，提示KP是一种Nrf2激活剂。与之一致，本研究发现KP可增加HaCaT细胞内Nrf2 mRNA和蛋白表达，且呈浓度依赖性；同时本研究发现低剂量KP可显著增加HO-1 mRNA表达，提示KP可能通过调控Nrf2/HO-1抗氧化信号通路发挥作用，尚需进一步实验验证。

综上所述，本研究表明驱虫斑鸠菊成分KP能上调Nrf2的表达，从而减轻AAPH诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤。同时，本研究表明驱虫斑鸠菊在抗氧化应激方面也具有一定的应用前景，有希望成为氧化应激相关疾病的治疗用药。