QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定海参中敌敌畏

张玲，丁洪流，纪丽君，叶湖 ，山珊，吴翠玲

1.苏州市食品检验检测中心（苏州 215104）；2.苏州市产品质量监督检验院（苏州 215104）；3.安捷伦科技（中国）有限公司（北京 100102）

海参齐名于鱼翅、燕窝和人参，被公认为世界八大珍品之一，含有生物活性物质，如皂苷、不饱脂肪酸和蛋白质[1-2]，是一种低脂肪、高蛋白食物。其营养价值高，具有延缓性腺衰老、提高记忆力、抗肿瘤及防止动脉硬化等作用。随着海参营养价值知识的普及，海参也作为一道菜品逐渐进入百姓的餐桌。正是由于海参在市场上十分走俏，即产生了行业乱象，已有调查表明海参产品良莠不齐，消费者对其难辨优劣，商家为了获取暴利，加胶基加糖现象已成了行业公开的秘密。另外，养殖环境对海参的品质有较大决定作用，央视“3·15晚会”曝光了海参养殖中使用敌敌畏现象的普遍性，海参养殖户在池塘中加入敌敌畏，其目的是清理池塘中的螃蟹、鱼虾等生物，而海参对敌敌畏的抗药性较强，不会被药死。按照我国农药管理条例规定，农药使用者不得扩大农药的使用范围，而敌敌畏的使用范围显然不包括海参养殖。敌敌畏具有高效、快速、广谱性等特点，是目前应用最为广泛的有机磷杀虫剂[3]，可用于农作物杀虫，但应有安全间隔期，一般规定在农作物收获前7 d停止用药。GB 2763—2019[4]对敌敌畏这种有机磷农药残留检测方法的具体规定为谷物按照GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]、SN/T 2324[7]方法检测；油料和油脂按照GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]方法检测；蔬菜、水果按照GB 23200.8[8]、GB 23200.113[5]、GB/T 5009.20[6]、NY/T 761[9]方法检测；调味料按照GB 23200.113[5]方法检测。另外，对敌敌畏的检测方法研究还有气质联用法[10-11]、液质联用法[12]等。以上这些方法更多见诸于对蔬菜、水果、谷物、油料和油脂等的检测。由于海参具有丰富的蛋白质，比果蔬等农药残留分析更为复杂，在现行农残分析标准中未见针对海参中敌敌畏的检测方法。

QuEChERS是一种在农产品方面检测的快速样品前处理技术[13]，具有操作简单、环保经济和适用范围广等特点。此次试验旨在建立一种基于QuEChERS前处理的高效液相色谱-串联质谱（High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）测定海参中敌敌畏方法，为执法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海参样品（市售）；敌敌畏（质量浓度为100 μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司）；QuEChERS萃取试剂盒（EN 15662，安捷伦科技有限公司）；Captiva EMR-Lipid固相萃取柱（200 mg，3 mL，安捷伦科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；甲酸、甲酸铵（质谱级，苏州精密化学科技有限公司）；试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

AgilentQQQ-6470、高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Mili-Q型超纯水仪（美国密理博公司）；ME204E电子天平（梅特勒-托利多集团）；Multi Reax自动涡旋仪（德国Heidolph公司）；MD200-1氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 敌敌畏标准溶液的配制

标准储备液：精密称取敌敌畏标准品，用甲醇溶液配制成质量浓度为10 μg/mL的溶液，作为标准储备液。

空白样品提取液：用不含敌敌畏残留的样品，按照1.3.2制备空白样品提取液。

标准工作溶液：精密吸取适量工作溶液，用甲醇溶液稀释成质量浓度为5，10，20，50和100 ng/mL标准工作溶液。

1.3.2 样品前处理

称取5 g（精确到0.001 g）鲜海参样品，置于50 mL离心管中，加入3 mL水，加陶瓷均质子涡旋1 min；加入10 mL乙腈，振荡3 min，加入Bond Elut QuEChERS EN萃取盐包，剧烈振荡1 min，以8000 r/min低温离心10 min，取2.4 mL乙腈提取液，置于15 mL离心管中，加0.6 mL水涡旋，过Captiva EMR-Lipid柱，重力自流，接收流出液，抽干小柱，合并接收液于15 mL离心管中，收集流出液在30 ℃条件下氮吹至小于1 mL，用乙腈定容至1 mL，过0.22 μm滤膜上机分析。

1.3.3 测定条件

1.3.3.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.7 μm，3.0 mm×100 mm）；流动相A：0.1%（V/V）甲酸-2 mmol/L乙酸铵；流动相B：0.1 %（V/V）甲酸-乙腈。梯度洗脱程序：0 min 80% A，4.0 min 10% A，6.0 min 10% A，6.5 min 80% A，9 min 80% A；流速：400 μL/min；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

1.3.3.2 质谱条件

离子化方式：正离子源喷雾（Positive electrospray ionization，ESI+），多反应监测（Multi reaction monitor，MRM）采集模式；干燥器温度250 ℃，干燥器流速7 L/min，雾化器电压30 psi，鞘气温度325 ℃，鞘气流速11 L/min，碰撞能量3500 V，喷嘴电压500 V。

1.4 数据处理

定性分析：在相同的色谱条件和质谱条件下，对照敌敌畏物质标准品定性离子以及出峰时间，对样品中敌敌畏物质进行定性分析。

定量分析：通过不同敌敌畏物质定量离子的峰面积，根据敌敌畏物质标准曲线的回归方程，计算样品中敌敌畏成分的含量。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

取敌敌畏标准品，采用多反应监测扫描模式进行子离子优化。质谱条件见1.3.3.2。母离子为M+1，液相部分只连接两通进行优化，优化后的质谱参数见表1，以响应信号最高的作为定量离子，响应信号次之的作为定性离子。

表1 敌敌畏多反应监测扫描模式的质谱参数

2.2 流动相的选择及洗脱梯度的优化

采用水及乙腈作为流动相，敌敌畏色谱峰呈现矮胖的形状，而采用乙酸铵及乙腈为流动相，目标物峰形尖锐，由于是采用正离子电离模式，在流动相中加入0.1%甲酸会更加有利于目标物离子化[14]，因此确定以0.1%（V/V）甲酸-2 mmol/L乙酸铵溶液（A）和0.1%（V/V）甲酸-乙腈（B）作为流动相。流动相洗脱梯度优化的最终结果见表2。结果显示，4 min内敌敌畏目标物出峰（图1），出峰时间为3.989 min。

表2 梯度洗脱程序

图1 敌敌畏物质的定量离子色谱图

2.3 固相萃取柱的选择

试验对样品的净化采用Captiva EMR-Lipid固相萃取柱。试验采用乙腈对海参中大量的蛋白物质进行提取和沉淀，对比了Bond Elut PPL和Captiva EMR-Lipid两类固相萃取柱的净化和保留效果，以加标回收率作为评价指标。结果显示，Captiva EMR-Lipid固相萃取柱的吸附及净化能力较好，能够有效地将海参样品中的色素及脂肪吸附，不仅有效地去除了对目标化合物的干扰物，还确保了待测组分较少的损失，能够在保证良好净化效果的同时使操作过程更简单。

2.4 检测方法的线性关系和检出限

标准曲线在5～100 ng/mL的质量浓度范围内线性关系良好，敌敌畏线性相关系数值为0.998，标准曲线见图2。以信噪比大于3为检出限，检出限为5 μg/kg。

表3 敌敌畏的线性试验结果

图2 敌敌畏标准曲线

2.5 方法回收率及精密度

选用鲜海参阴性样品，对其添加不同浓度敌敌畏标准物质，加标回收试验的3个水平加标量分别为10，20和40 μg/kg，每个水平重复6次测定，结果见表4。结果显示，加标回收率在80%～89%之间，相对标准偏差为2.78%～3.56%（n=6），方法精密度及准确度均较高。海参样品加标质谱图谱见图3。

表4 敌敌畏的加标回收率结果（n=6）

图3 敌敌畏成分加标质谱图谱

2.6 样品应用

为了进一步验证试验方法的实用性，将其他市售干制海参及新鲜海参按照所优化的条件进行检测，结果均未检出。今后将进一步加大抽样量并扩大抽样样品品类，对新建方法进行充分验证。

3 结论与讨论

试验采用QuEChERS前处理的方法，提高了海参中敌敌畏物质农药残留定量的准确度和重现性。试验利用液质联用仪进行检测，该方法简单易行、可操作、准确灵敏、基质干净以及减少仪器污染，既提高工作效率，又节约劳动成本，可为海参中敌敌畏物质农药残留的检测提供科学客观、准确可靠的方法。