大别山野菊花挥发油的成分及抗菌活性

余科义，薄新党，王文辉

河南应用技术职业学院（郑州 450042）

野菊（Chrysanthemum indicumL.）是菊科多年生草本植物，常生长在原野、田边，在中国的东北部及西南地区最为常见，资源丰富。野菊花是野菊的球形头状花序，呈棕黄色，其性味苦辛，微寒，具有疏风散热、泻火平肝、清热解毒的功效[1]，可用作中药、清凉饮品、药枕等，夏桑菊颗粒、感冒灵颗粒等复方药物中均含有野菊花成分。野菊花含有黄酮类、挥发油类、萜类、苯丙素类、甾醇类、蒽醌类等多种化学成分[2-7]，其中黄酮类、挥发油类和萜类含量较高，也是起药效作用的主要成分。野菊花的提取物还具有抑菌[8-9]、消炎镇痛[10-11]、解毒[12]、抗氧化[13-15]、抗肿瘤[16-17]等多种生物活性。在现代医学中野菊花可以用于预防治疗感冒，治疗肝炎、高血压、高血脂、湿疹、呼吸道感染等症状[18-20]。野菊花挥发油通常采用水蒸气蒸馏法提取，提取率在2.0%左右[21]，有160余种化合物从挥发油中分离出来[22]，以倍半萜类、单萜类及其含氧衍生物为主要成分[23-24]。α-姜黄素、β-半水芹烯和樟脑是中国产野菊花挥发油的主要成分[25]，菊酮、1,8-桉油醇和α-蒎烯是韩国产野菊花的主要成分[23]。国产野菊花因产地不同，主要成分和含量也有所不同，活性也存在一定差别。试验对大别山地区产野菊花的挥发油开展研究，并初步探究其对4种常见致病菌的抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料

野菊花采（摘自河南省信阳市大别山山区，为野菊的头状花序）。

吐温-80（食品级）；琼脂（食品级）；阿莫西林（分析纯）；其余试剂为化学纯。

1.2 菌株

菌种（菌种批号20190918，分别为大肠埃希菌（Escherichia coli），菌种编号CMCC（B）44102，青岛日水生物技术有限公司）；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，菌种编号CMCC（B）26003）；铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，菌种编号CMCC（B）10104）；粪肠球菌（Enterococcus faecalis，菌种编号CMCC（B）29212）。

1.3 仪器与设备

QP-2010PLUS型岛津气质联用仪（日本岛津仪器设备有限公司）；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；CS-700型超帅高速多功能粉碎机（武义海纳电器有限公司）；KQ-800KDE型高功率数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；HT-350B型恒温培养箱（常州市金城春兰实验仪器厂）；XFS-280A型压力蒸汽灭菌锅（绍兴市景迈仪器设备有限公司）；超净工作台（河南贝亚生物科技有限公司）；恒温培养箱（郑州鑫尔瑞化验用品有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 野菊花挥发油的提取

利用超声辅助水蒸气蒸馏法提取野菊花的挥发油。将干燥的野菊花用粉碎机进行粉碎，过0.300 mm孔径筛，称取40 g粉末，按固液比1∶8（g/mL）的比例加入一定量的去离子水于500 mL单颈烧瓶中，封口，充分浸泡16 h，在100 W功率下超声破碎处理30 min，将烧瓶放入120 ℃恒温油浴锅中，在磁子搅拌下蒸馏提取8 h。停止加热，自然冷却一段时间，收集挥发油，加入少量无水硫酸钠进行干燥，将干燥后的挥发油用移液管转移到另一个干净的锥形瓶中，贴上标签，用保鲜膜封口，置于4 ℃冷藏室保存备用。

1.4.2 野菊花挥发油成分GC-MS分析

1.4.2.1 气相色谱（GC）条件

色谱柱RXI-SiL-MS（30 m×250 μm×0.25 μm），载气采用高纯氦气（99.999%），进样口温度250 ℃，载流量2 mL/min，分流比2∶1，进样量1 μL。

1.4.2.2 程序升温

升温程序：柱温45 ℃，保持1 min，以3 ℃/min速率升温至120 ℃，保持5 min，以5 ℃/min速率升温至220 ℃，保持10 min。

1.4.2.3 质谱（MS）条件

电子轰击EI为电离源，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，电离能量70 eV，质量扫描范围为m/z35～500，间隔0.2 s。

1.4.3 野菊花挥发油抗菌活性检测

1.4.3.1 培养基的制备

配制牛肉膏蛋白胨液体培养基，加入吐温-80，制成含1%吐温-80的牛肉膏蛋白胨液体培养基，分装于三角瓶中，于121 ℃灭菌30 min，于4 ℃冷藏备用。

1.4.3.2 固体平板的制备

配制牛肉膏蛋白胨液体培养基，加入凝固剂琼脂（琼脂质量分数1.5%），制成固体培养基，于121 ℃灭菌30 min，倒入灭菌的培养皿中制成平板，冷却至常温，于4 ℃冷藏备用。

1.4.3.3 菌悬液的制备

将菌种接种到斜面培养基上，于37±1 ℃培养18～24 h，取出后加入无菌生理盐水，用接种环刮下菌苔，制成菌悬液，于4 ℃冷藏备用。

1.4.3.4 野菊花挥发油乳浊液的配制

将野菊花挥发油用含1%吐温-80的牛肉膏蛋白胨液体培养基溶解，制成质量浓度32 mg/mL的待检样品溶液，灭菌后于4 ℃冷藏，作为待测样品备用。

1.4.3.5 最低抑菌浓度（MIC）的测定

采用连续稀释法测试野菊花挥发油的抑菌效果。取11支无菌试管（20 mm×300 mm），编号分别为1～8、阴性对照、阳性对照、空白对照。1～8号管分别加入4 mL肉膏蛋白胨培养基，取4 mL的待检样品加入1号管中，混匀后从中取出4 mL加入2号管中，混匀后从中取出4 mL加入3号管中，以此类推稀释至8号管，从8号管取出4 mL溶液。1～8号管中都是4 mL待检样品溶液，浓度依次为C0×（1/21），C0×（1/22），…，C0×（1/28）（C0=16 mg/mL），用无菌微量移液器分别移取0.1 mL菌悬液于1～8号管中。用液体培养基配制4 mL 0.85 mg/mL阿莫西林（AM）溶液，加入0.1 mL菌悬液，作为阳性对照组。以加有0.1 mL菌悬液的4 mL培养基作为阴性对照组。以4 mL培养基为空白对照组。将11支试管共同放入37±1 ℃恒温箱培养24 h后，根据文献[26]报道的方法，肉眼观察浊度以确定样品的抑菌效果，MIC值是不显示浊度的药液浓度。开展4次平行试验，取平均值。试验过程如表1所示。

表1 野菊花挥发油抑菌试验测定过程

1.4.3.6 最低杀菌浓度（MBC）的测定

根据MIC的试验结果，对有抑制作用的菌组采用平板涂布法进行MBC的测定。采取上述1.4.3.5相同的方法，用培养基配制6组4 mL不同浓度的待测样品溶液（编号为Ⅰ～Ⅵ），加入0.1 mL菌悬液（有抑菌效果的菌组）进行固体平板涂布培养。以涂布有0.1 mL菌悬液的4 mL培养基作为阳性对照组，以4 mL培养基为空白对照组。上述试验样品共同放入37±1 ℃恒温箱培养24 h，观测菌落生长情况，以没有菌落生长的最低药液浓度为MBC值。做4次平行试验，取平均值。

2 结果与分析

2.1 野菊花挥发油成分分析结果

按照1.4.1的方法提取的野菊花挥发油呈淡黄色液体，具有菊花芳香气味。做5次平行试验，挥发油提取率相对稳定，为0.4110%±0.005%（W/W）。通过GC-MS联用技术获得总离子流图（见图1），经质谱扫描后获得各峰的质谱图，通过质谱库NIST08中数据匹配检索，并结合保留指数和文献报道共同进行定性分析，共鉴定出化合物48种，按峰面积归一化法计算各成分的质量分数，结果见表2。

图1 野菊花挥发油总离子流

由表2可知，在鉴定出的48个化合物中，质量分数最高的3种物质分别是顺式马鞭草烯醇（15.81%）、广藿香烷（11.55%）和十烷酮（10.21%），质量分数均大于10%，占总质量分数的37.57%。此外，2,6,6-三甲基-3-（2-丙烯基）二环[3,1,1]庚烷、4-亚甲基-1-甲基-2-（2-甲基-1-丙烯基）-1-乙烯基环庚烷、氧化石竹烯、9-十八碳烯-12-炔酸甲酯、1,5-二甲基-3-羟基-8-（1-亚甲基-2-羟乙基）二环[4.4.0]癸-5-烯、（E）-β-金合欢烯等成分的质量分数在3%以上。

表2 野菊花挥发油化学成分

2.2 抑菌活性试验结果

采用连续稀释法测试野菊花挥发油对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和粪肠球菌的抑菌效果，试验结果如表3所示。

表3 野菊花挥发油抑菌试验结果

结果表明，野菊花挥发油对金黄色葡萄球菌有较强的抑制活性，对粪肠球菌的生长有一定的抑制作用，MIC分别为1 mg/mL和4 mg/mL。但对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌没有发现有抑制活性。

2.3 杀菌活性试验结果

因为野菊花挥发油对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌有抑制作用，用固体平板涂布法测定野菊花挥发油对这2种菌组的最低杀菌浓度（MBC），试验方法见1.4.3.6，试验结果如表4所示。

分析表4的结果可以得出，野菊花挥发油对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌最低杀菌浓度（MBC）分别为2 mg/mL和6 mg/mL，对金黄色葡萄球菌具有较强的杀菌活性。试验测得的大别山野菊花挥发油抑制金黄葡萄球菌的活性高于钟灵允等[8]测得成都地区野菊花挥发油的活性（MIC值为2 mg/mL，MBC值为2.5 mg/mL）。

表4 野菊花挥发油杀菌试验结果

3 结论

野菊花是传统中草药，具有清热解毒、疏风散热、散瘀、明目和降血压之功效，可作饮品，还可以用于牙膏、药皂等日用品，是药食两用植物。试验以大别山地区产野菊花为研究对象，采用超声辅助水蒸气蒸馏法提取野菊花挥发油，在固液比1∶8（g/mL）、功率100 W、超声时间30 min、蒸馏温度130℃、蒸馏时间8 h条件下，野菊花挥发油的提取率为0.4110%±0.005%（W/W）。利用GC-MS联用技术鉴定出野菊花挥发油的48种化学成分，主要为萜类、脂肪族类化合物和萜类衍生物，其中，顺式马鞭草烯醇（cis-verbenol）、广藿香烷（patchoulane）和十烷酮（1-decalone）的质量分数较高（＞10%）。抗菌活测定结果表明，野菊花挥发油对金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性，其MIC和MBC别为1 mg/mL和2 mg/mL，对粪肠球菌有一定的抑制作用，其MIC和MBC别为4 mg/mL和6 mg/mL，但对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌没有抑制活性。野菊花挥发油的抗菌活性可能是其主要成分（马鞭草烯醇、广藿香烷和十烷酮）发挥作用，但需要进一步研究确定。挥发油是野菊花重要的药效组分，其抗菌活性展现出其在医药领域的重要应用地位，具有很好的开发利用价值。