高选择性MRM3液质联用技术检测复杂动物性食品中β-受体激动剂残留

孙 雷，叶 妮，王亦琳，尹 晖，翟南南，王鹤佳*，徐士新

(1. 中国兽医药品监察所，北京 100081；2. Sciex公司，北京 100016)

克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等β-受体激动剂是一类化学合成的苯乙醇胺类物质，人们食用了这些药物残留的动物性食品后会出现面色潮红、头痛、头晕、胸闷、心悸、四肢麻木等不良反应症状，严重的可能危及生命。因此，包括我国在内的很多国家先后立法禁止该类药物的使用。

目前，β-受体激动剂残留检测方法主要有气相色谱-质谱法[1-4]、液相色谱-串联质谱法[5-12]以及免疫分析法[13-14]等。与其他方法相比，液相色谱-串联质谱法不用衍生化反应，可以有效的降低干扰，大幅度的提高选择性，从而为检测方法提供了极低的基线、极优的定量限和良好的线性。但像猪肝脏等基质复杂动物性食品，当药物含量较低时，使用串联质谱技术传统的MRM采集模式有时并不能消除来自本底噪音或者其它物质的干扰，就会导致较高的基线、较差的定量限和重现性，检测结果存在假阳性或假阴性的风险。在这种情况下，增加一级质谱即第三级质谱(MS/MS/MS，或MS3)，采用MRM3采集模式，可以更有效的消除基质干扰，降低本底基线，进一步提高方法的选择性，为检测工作提供更准确可靠的技术支持。

基于高选择性的MRM3液质联用技术建立猪肝脏等复杂动物性食品中克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇残留检测的新方法，使方法稳定性好，选择性强，灵敏度高，为提高β-受体激动剂类药物的残留监控能力，保障动物性食品质量安全提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器 液相色谱-三重四极杆/线性离子阱复合质谱仪(Qtrap 6500，美国SCIEX公司)；漩涡混合器(SIR4，广州IKA公司)；电热恒温振荡水槽(DKZ-2型，上海精宏实验设备公司)； pH计(Delta 320，Mettler Toledo仪器(上海)有限公司)；高速冷冻离心机(Biofuge Strators，德国贺利氏公司)；氮吹仪(Organomation Associates，美国Jnc公司)；超纯水机(Milli-Q，美国Millipore公司)。

1.2 材料、药品与试剂 克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇(纯度均大于98.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；乙酸乙酯、叔丁基甲醚和甲酸(色谱纯，美国Fisher公司)；MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL，美国 Waters公司)；微孔滤膜(0.22 μm，美国Pall公司)；所用水为超纯水。

1.3 标准溶液的配制 精密称定适量的克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇标准品，用甲醇溶解并配制成浓度为1 mg/mL的标准储备液，于-20 ℃下保存。准确吸取0.1 mL克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇标准储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10 μg/mL的标准工作液，于-20 ℃下保存。

1.4 色谱条件 色谱柱：Phenomenex F5(50 mm×3.0 mm，2.6 μm)；柱温：30 ℃；流动相A：0.1%甲酸溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液；进样量：5 μL；流速：0.5 mL/min。梯度洗脱程序：0～0.5 min保持5%B；0.5～5 min，5%B线性变化到60%B，5～6 min，保持95%B，6～7.5 min保持5%B。

1.5 质谱条件 离子源：电喷雾离子源正离子模式；扫描方式：三级质谱多反应监测(MRM3)模式；离子化电压(IS)：5500V；源温(TEM)：550 ℃；气帘气(CUR)：30 psi；碰撞气(CAD)：Medium；雾化气(GS1)：50 psi；辅助气(GS2)：60 psi。MRM3监测离子对及质谱参数见表1。

表1 克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇MRM3监测 离子对、去簇电压、碰撞能量和激发能量Tab 1 Monitoring ion pairs, declustering potentials (DP)、collison energies(CE) and excitation energy(AF2) of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

1.6 样品处理方法 准确称取2(±0.02)g待测样品于50 mL离心管内，加入0.2 mol/L乙酸铵缓冲溶液(pH=5.2)8 mL，再加入β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶40 μL，涡旋混匀，37 ℃下避光水浴振荡16 h。酶解后放置至室温，涡旋混匀，10 000 r/min离心10 min，倾出上清液于另一50 mL离心管内，用10 mol/L NaOH溶液调pH至10±0.5。加入乙酸乙酯15 mL，中速振荡10 min，5 000 r/min离心5 min，取上层有机相至另一50 mL离心管内。下层水相中再加入叔丁基甲醚10 mL，中速振荡10 min，5 000 r/min离心5 min，取上层有机相，合并于乙酸乙酯萃取液中，50 ℃下氮气吹干，用2%甲酸溶液5 mL溶解，备用。MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水溶液各3 mL活化，取备用液全部过柱，依次用2%甲酸水溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脱。洗脱液50 ℃下氮气吹干，残余物中加入10%甲醇溶液(含0.1%甲酸)0.5 mL，充分溶解，过0.22 μm滤膜后供上机测定，采用基质添加标准溶液外标法定量。

2 结果与分析

2.1 三级质谱MRM3采集离子对结果 使用50%甲醇溶液作为溶剂，配制100 ng/mL的克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇标准溶液，采用针泵恒流进样的方式，进行质谱参数优化。在正离子全扫描模式下先进行一级质谱扫描(MS1)获得母离子信息。然后，设定一定的碰撞能量，进行二级质谱子离子扫描(MS2)，获得一个二级子离子信息。最后，设定一定的激发能量，进行三级离子阱质谱孙离子扫描(MS3)，获得两个三级孙离子信息。最终选定的离子对分别为克仑特罗277.0>203.0>132.1和277.0>203.0>168.0、莱克多巴胺302.1>284.1>121.1和302.1>284.1>164.2、沙丁胺醇240.3>222.2>148.1和240.3>222.2>166.1。根据欧盟2002/657/EC规定的一个母离子1个IP，一个子离子及一个孙离子各1.5个IP，可以得出每种药物各5.5个IP，远超过规定的禁用药物4个IP要求，很好的满足了法规对于禁用药物的规定。三种药物的MRM3典型质谱图见图1。

图1 克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的MRM3质谱图Fig 1 MRM3 mass spectrum of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

2.2 方法学考察

2.2.1 方法线性 添加适量克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇混合标准工作液于空白猪肝脏组织中，制得浓度为0.5、1、2、5、10 μg/kg的系列基质添加样品，经前处理后依次上机测定。以基质添加标准溶液浓度为横坐标，各药物定量离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(表2)。可以看出三种药物在0.5～10 μg/kg的系列浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数(R2)均大于0.99。

2.2.2 方法灵敏度和精确度 采用空白添加目标化合物的方法，依据特征离子质量色谱峰信噪比S/N>10为方法定量限，得出三种药物在猪肝脏组织中的定量限均为0.5 μg/kg。0.5 μg/kg空白猪肝脏添加样品，经前处理后获得的克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇三级质谱特征离子质量色谱图见图2。

图2 克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇三级质谱特征离子质量色谱图Fig 2 MRM3 chromatograms of clenbuterol、ractopamine and salbutamol

添加0.5、2和10 μg/kg三个浓度水平的药物，进行方法回收率和精密度考察，结果发现克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的回收率范围在89.7%-102.1%，批内批间RSD均小于20%(表3)。

表2 三种药物标准曲线及相关系数Tab 2 Calibration curves and correlation coefficients of three drugs in pig liver

3 讨论与结论

3.1 样品前处理方法 β-受体激动剂在动物体内代谢过程中，在葡萄糖醛酸转移酶、硫酸酯等作用下发生各种轭合反应，生成各种轭合物长期存在，因此在样品提取前要进行酶解，使其结合态的待测物解离释放出来。有关酶解的方法、酶的品种、酶用量、酶解时间均有人做过研究，本方法直接参考了这些研究报道[5,10-11]。为了提取酸性水溶液中成盐的β-受体激动剂，先用氢氧化钠溶液调pH至碱性，使药物呈游离状态，然后为兼顾不同性质的β-受体激动剂，本方法参考已有文献，选择了疏水性的乙酸乙酯和叔丁基甲醚从水相中萃取药物的方法[5]。猪肝样品中含有大量的复杂基质，严重干扰残留测定，本方法参考已有报道，选用混合型阳离子交换固相萃取柱(MCX)作为净化柱，起到了较好的净化效果[8-12]。

表3 空白猪肝脏中三种药物添加回收率实验结果(n=5)Tab 3 Average recoveries and precisions(RSD) of three drugs in spiked blank pig liver (n=5)

3.2 三级质谱MRM3模式检测的优点 在日常检测过程中，对于猪肝脏等基质复杂动物性食品，当检测β-受体激动剂等禁用药物在含量较低的情况下，有时会出现色谱峰的干扰，给方法的准确定性定量带来困扰，采用三级质谱的MRM3模式可以有效的去除本底或基质带来的干扰，使目标化合物的测定具有更高的选择性。例如，对猪肝脏空白样品采用传统的MRM模式检测时，有时会发现有共流出物质干扰目标物克仑特罗的测定(图3左)，从而造成假阳性结果，在使用MRM3模式后，因为三级质谱MRM3的高选择性，完全消除了空白样品中共流出物的干扰，得到毫无干扰的空白样品色谱图(图3中)及空白添加样品色谱图(图3右)。

图3 空白猪肝脏MRM和MRM3色谱图及空白添加样品MRM3色谱图Fig 3 MRM and MRM3 chromatograms of blank pig liver and MRM3 chromatograms of blank pig liver spiked

研究建立了高选择性MRM3液质联用技术检测猪肝脏等复杂动物性食品中克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇残留检测的新方法。该方法采用三级质谱MRM3模式通过对母离子、子离子和孙离子三级离子的监测，使方法的选择性更强，灵敏度更高，回收率和精密度等技术参数都能满足兽药残留分析方法的要求，为进一步提高β-受体激动剂类药物的残留监控能力，保障动物性食品质量安全提供了技术支持。