超高效液相色谱-三重四极杆/线性离子阱复合质谱法测定鸡蛋中黏菌素残留的研究

尹 晖，王亦琳，叶 妮，孙红洋，孙 雷，王鹤佳

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

近期，贵州首例鸡蛋被查出禁用药氟苯尼考案宣判，鸡蛋中的兽药残留问题和随之引发的食品安全问题再度引起社会关注。黏菌素(Colistin)属于多肽类抗生素，是30多种成分的混合物，主要成分为黏菌素A和黏菌素B[1-2]，其结构为由七环和末端的三肽组成的十肽菌素，对革兰氏阴性杆菌具有较强的抗菌作用，广泛应用于治疗猪及禽类肠道大肠杆菌感染，曾经作为饲料添加剂还有促进动物生长作用[3]。大量使用黏菌素会对动物的肾和神经系统造成较大的毒害性[4]，并以药物原形或其代谢产物形式在动物可食性组织(如蛋、奶)中形成药物残留，影响食品质量安全，进而影响人类健康，因此欧盟制定了黏菌素在动物可食用组织中的最高残留限量标准[5]，我国食品安全国家标准GB 31650-2019中规定的黏菌素最高残留限量与欧盟一致，其中鸡蛋中黏菌素的残留标志物为黏菌素A和黏菌素B之和，最大残留限量(MRL)为300 μg/kg[6]。目前鸡蛋中黏菌素残留检测方法的报道较少[7]，文献报道多为对其他动物组织、牛奶、饲料中黏菌素残留检测方法[8-11]。我国也尚未发布动物性食品中黏菌素残留量测定的国家标准和行业标准。本研究应用三重四极杆/线性离子阱复合质谱技术(QTRAP)，在四极杆的高灵敏度基础上，增加了线性离子阱增强子离子扫描的定性功能，可以得到能够二次定性的EPI指纹图，进一步提高了兽药残留检测中痕量分析定性的准确度[12]。本研究拟建立一种检测鸡蛋中黏菌素残留的UPLC-MS/MS方法，应用最新的三重四极杆/线性离子阱复合质谱技术(QTRAP)，以为鸡蛋的食品安全监控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备 Shimadzu 30A-6500 QTRAP液相色谱-串联质谱仪，日本岛津公司-美国AB SCIEX公司； XS105DU分析天平，Mettler Toledo公司；AE260电子天平，Mettler Toledo公司；Biofuge Strators高速冷冻离心机，贺利氏公司；SIR4涡旋混合器，IKA公司；氮吹仪，Jnc公司。

1.2 药品和试剂 黏菌素A、黏菌素B，纯度均>98%。来自日本明治制果药业株式会社；甲酸、乙腈为色谱纯，均购自MERCK公司；所用水为超纯水。

1.3 空白鸡蛋 从超市购买不同批次的鸡蛋，经检测筛选出不含黏菌素的鸡蛋，充分匀浆后用作空白鸡蛋。

1.4 对照溶液配制 精密称取黏菌素A和黏菌素B标准品适量，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为1 mg/mL的标准储备液；量取标准储备液适量，用甲醇稀释成10 μg/mL的标准工作液，再用甲醇稀释成1 μg/mL的标准工作液。

1.5 测定方法

1.5.1 色谱条件 色谱柱为BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，流动相A相为0.5%甲酸水溶液，B相为0.5%甲酸乙腈溶液，流动相梯度洗脱程序见表1，柱温30 ℃，进样量5 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution conditions of mobile phase

1.5.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI+)，采用多反应监测-信息依赖扫描-增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)方式采集，电喷雾电压(IS)为5500 V，离子源温度为550 ℃，气帘气(CUR)为30 psi，碰撞气(CAD)为高等(High)，辅助气(GS1)为50 psi，辅助气(GS2)为60 psi；IDA参数：动态背景扣除，从不排除之前的目标离子，触发阈值100 cps；EPI参数：扫描范围为80～400m/z，扫描速度10000 Da/s，CE为20 eV，CES为5 eV。待测药物定性定量离子对及对应的去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)见表2。

表2 黏菌素定性定量离子对及对应的去簇 电压(DP)和碰撞能量(CE)Tab 2 Qualitative ions, corresponding quota ions of Colistin and corresponding declustering potential(DP), collision energy(CE)

1.5.3 定性与定量 定性时试样溶液中色谱峰的保留时间，应与校正溶液的保留时间一致，容许偏差为±2.5%，试样溶液中的离子丰度比应与校正溶液的一致，容许偏差符合欧盟2002/657/EC决议要求。线性离子阱获得增强子离子扫描(EPI)谱图，应与校正溶液的EPI谱图匹配。定量方法采用基质匹配标准溶液外标法定量。

1.5.4 基质匹配标准曲线绘制 精密量取黏菌素标准工作液适量，用0.5%甲酸水溶液稀释成浓度为10、25、50、100、200和400 ng/mL的系列标准工作液，从中各取1.0 mL，分别加入到空白鸡蛋试料经提取、净化和吹干后的残余物中，充分溶解，过滤，过0.2 μm滤膜后，作为浓度为20、50、100、200、400和800 μg/kg的系列基质匹配标准溶液上机测定。按所得峰面积与相应的对照溶液浓度作标准曲线，并计算回归方程及相关系数。

1.5.5 样品前处理过程 称取鸡蛋(5±0.05)g于50 mL离心管中，加入25%甲醇水溶液25 mL，涡旋2 min，再加入1 mol/L硫酸2 mL，中速振荡10 min，3000 r/min离心5 min，取上清液。向残渣中加入25%甲醇水溶液15 mL，同样的方法重复提取1次，合并上清液。合并的提取液中加入正己烷25 mL，振荡5 min，5000 r/min离心10 min，弃上层正己烷，并将下层提取液定容至50 mL，备用。Plexa固相萃取柱依次用10 mL甲醇、10 mL水活化，取备用液5 mL过柱，然后用10 mL水洗涤，最后用1%甲酸﹕甲醇(1∶4，V/V)溶液5 mL洗脱，洗脱液于40 ℃水浴氮气吹干。向残余物中加入0.5%甲酸水溶液1.0 mL，充分溶解，过0.22 μm微孔滤膜后供液相色谱-串联质谱测定。

1.5.6 方法灵敏度确定 将适量黏菌素标准工作液加入到空白鸡蛋中，经上述方法进行前处理后，用UPLC-QTRAP检测，观察药物特征离子质量色谱峰信噪比(S/N)和对应药物浓度，S/N>3者为方法的检测限，S/N>10者为方法的定量限。

1.5.7 准确度和精密度的测定 采用标准添加法，在空白鸡蛋试料中分别添加30、150、300 μg/kg三个不同浓度药物进行回收率试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，求平均回收率、批内、批间RSD。

2 结果与分析

2.1 定性分析 本研究使用MRM-IDA-EPI扫描模式，当MRM通道采集的信号超过100 cps时触发EPI增强离子扫描，在保留时间2.05～2.17 min左右获得3个不同碰撞能量(15、20、25 eV)的EPI谱图，得到更多子离子信息。将空白鸡蛋添加试样和黏菌素标准溶液的EPI谱图进行比对，得到6个匹配的子离子，表明本方法定性高度准确。黏菌素基质匹配标准溶液和空白鸡蛋添加试样的EPI谱图见图1～图2。

1. 黏菌素A; 2. 黏菌素B 1. Colistin A; 2. Colistin B图1 黏菌素基质匹配标准溶液的EPI谱图Fig 1 EPI(Enhanced Product Ion)of Colistin in matrix-matched standard solution

1. 黏菌素A; 2. 黏菌素B 1. Colistin A; 2. Colistin B图2 空白鸡蛋添加黏菌素试样的EPI谱图Fig 2 EPI(Enhanced Product Ion)of Colistin in blank eggs spiked samples

2.2 基质匹配标准曲线 按照上述系列基质匹配标准溶液浓度进行线性回归，得到的回归方程及相关系数见表3。从表中可以看出，鸡蛋中黏菌素在20～800 μg/kg的浓度范围内呈现良好的线性关系，R2大于0.990。

2.3 方法灵敏度 按上述方法进行处理，当添加浓度为30 μg/kg时，测得黏菌素的S/N>10，说明方法定量限为30 μg/kg；当添加浓度为10 μg/kg时，测得黏菌素的S/N>3，说明方法检测限为10 μg/kg。30 μg/kg空白鸡蛋添加试样中黏菌素的特征离子质量色谱图见图3。

表3 鸡蛋中黏菌素基质匹配标准曲线Tab 3 Matrix-matched standard curve of Colistin in Eggs

2.4 方法的回收率和精密度 在空白鸡蛋中添加低、中、高三个不同浓度的黏菌素进行回收率试验，结果汇总见表4。可以看出，空白鸡蛋中黏菌素A和黏菌素B在30～300 μg/kg添加浓度范围内的回收率为67.2%～106%，批内、批间RSD均<20%。

3 讨论与结论

3.1 提取溶剂的选择 黏菌素属于多肽类抗生素，分子结构中含有多个氨基，极性较强，易溶于水，可以使用极性溶剂进行提取，经过比较试验，本研究采用25%甲醇作为样品的提取液，结果表明提取充分，回收率较高。

1. 黏菌素A(390.8>101.2); 2. 黏菌素A(390.8>385.0); 3. 黏菌素B(386.2>101.0); 4. 黏菌素B(386.2>380.1) 1. Colistin A(390.8>101.2); 2. Colistin A(390.8>385.0); 3. Colistin B(386.2>101.0); 4. Colistin B(386.2>380.1)图3 空白鸡蛋添加试样溶液中得到的特征离子质量色谱图(30 μg/kg)Fig 3 Qualitative ions of Colistin in Eggs(30 μg/kg)

表4 空白鸡蛋中黏菌素添加回收试验结果Tab 4 Recoveries of Colistin in Eggs spiked samples

3.2 净化条件的选择 鸡蛋样品中含有蛋白质和脂肪等大量杂质，会对检测结果产生基质效应，本研究通过高速离心去除蛋白质等大量杂质的干扰，采用正己烷去除脂肪，有效地提取黏菌素药物残留。固相萃取法是常见的净化方式，黏菌素可采用Strata-X[7]或HLB[13]固相萃取柱净化，考虑到黏菌素分子结构中含有多个氨基，经过比较试验，本研究采用聚合阳离子交换Plexa固相萃取柱净化，可以有效吸附基质中的中性和酸性干扰物，降低基质效应。

3.3 定性分析 根据欧盟2002/657/EC要求，要确证黏菌素至少需要3个识别点(IP)，在大多数检测方法中，一般选定母离子及两个响应较强的子离子作为定性定量依据，母离子是1个IP点，两个子离子分别是1.5个IP点，共4个IP点，满足检测要求。本研究采用QTRAP质谱仪特有的MRM-IDA-EPI扫描模式，对目标母离子进行EPI增强子离子扫描，在保留时间左右获得更多子离子的信息，得到黏菌素子离子的特征性EPI指纹谱图，该谱图具有高度特异性，将空白鸡蛋添加试样和黏菌素标准溶液的EPI谱图进行比对后，进行二次定性，得到母离子和6个匹配的子离子，共10个IP，极大地提高了定性的准确性。

本研究利用超高效液相色谱-三重四极杆/线性离子阱复合质谱技术建立了鸡蛋中黏菌素的残留检测方法，前处理方法简便快速，定量准确，EPI指纹图二次定性特异性强，极大提高了定性的准确性，为鸡蛋的食品质量安全监控提供了重要的技术支持。