基于HPLC的蝎子草三种有效成分含量测定

李欣燃 罗泽丽 王绪英

（六盘水师范学院 生物科学与技术学院，贵州 六盘水553001）

蝎子草（Girardinia suborbiculataC.J.Chen）为荨麻科（Urticaceae）蝎子草属（Girardinia）一年生草本植物，具有抗炎、镇痛、除湿、抑菌、降尿酸和降血糖等多种生物学活性[1-8]，是一种传统的民族草药。在我国东北、华北、华中及西南等地均有所分布，且在生长地区用药历史悠久，鉴于其广泛的药理作用，蝎子草具有较高的研究价值。

2000年我国首次将指纹图谱纳入中药质量标准的管理法规[9]，该检测方法在药用植物中的应用比较广泛，目前已成为控制中药材质量的一种重要手段，其能将中药材的有效成分和比例通过图谱的形式展现出来，常用来作为评价和控制药材中有效成分的主要方法[10]。

本实验以蝎子草为研究对象，利用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）构建指纹图谱的方法，比较索氏提取法和超声波辅助提取法对蝎子草主要药效成分β-谷甾醇、山萘素以及东莨菪内酯三种物质提取量的影响，为中药材蝎子草资源的药用成分质量控制及进一步的开发利用提供参考依据。

1 试验材料

1.1 材料与试剂

蝎子草采自贵州省六盘水市六枝特区，经六盘水师范学院植物科学教研室鉴定为荨麻科蝎子草属蝎子草。

β-谷甾醇、山萘素、茛菪亭内酯均为标准品（安徽酷尔生物工程有限公司）。甲醇、乙腈为色谱纯（河南萨默生物科技有限公司），三氯甲烷、乙醇、磷酸、盐酸、石油醚等试剂均为分析纯（洛阳昊华化学试剂有限公司）。

1.2 主要仪器

TD5离心机（湖南赫西），高效液相色谱仪（日本岛津LC-2010A），万能粉碎机（林大机械DFT-200），水浴锅（科伟永兴HH-2A），电子分析天平（日本岛津ATY-12），超声波清洗仪（新芝生物SB-800DT）。

2 研究方法

2.1 标准曲线制作

2.1.1 β-谷甾醇标准曲线制作

将β-谷甾醇标准品用甲醇溶液配制成质量浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的标准溶液并按以下色谱条件进样：色谱柱Diamonsil(TM)C18 (250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为99%甲醇，检测波长210 nm，流速为1.0 mL/min，柱温40℃，进样量30μL时，记录峰面积并绘制标准曲线。

2.1.2 山萘素标准曲线的制作

将山萘素标准品用甲醇溶液配制成质量浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL的标准溶液，并按以下色谱条件进样：色谱柱Diamonsil(TM)C18(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸混合液（65∶35,V/V），检测波长367 nm，流速为0.8 mL/min，柱温25℃，进样量10μL，记录峰面积并绘制标准曲线。

2.1.3 茛菪亭内酯标准曲线制作

将茛菪亭内酯标准品用甲醇溶液配制成质量浓度分别为0.034 mg/mL、0.068 mg/mL、0.102 mg/mL、0.136 mg/mL、0.17 mg/mL的标准溶液，并按以下色谱条件进样：色谱柱Diamonsil(TM)C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸（65∶35,V/V），检测波长344 nm，流速为0.8 mL/min，柱温25℃，进样量10μL，记录峰面积并绘制标准曲线。

2.2 三个成分的提取

2.2.1 β-谷甾醇的提取

称取蝎子草粉末10.0 g于纱布袋内，加入三氯甲烷200 mL。索氏提取：提取2 h，3000 r/min离心5 min，取上清，重复提取一次，合并上清液于恒温水浴锅浓缩至干燥；超声波提取30 min，3000 r/min离心5 min，取上清，重复提取一次，合并上清液于恒温水浴锅浓缩至干燥。

2.2.2 山萘素的提取

称取蝎子草粉末10.0 g于纱布袋内，加入70%甲醇与4 mol/L盐酸（5∶1,V/V）混合物300 mL。索氏提取：3 h，3000 r/min离心5 min，取上清后，重复提取一次，合并上清液于恒温水浴锅上浓缩至干燥；超声波提取90 min，3000 r/min离心5 min，取上清，重复提取一次，合并上清液于恒温水浴锅浓缩至干燥。

2.2.3 东茛菪内酯的提取

称取蝎子草粉末10.0 g于纱布袋内，加入95%乙醇150 mL。索氏提取：2 h，3000 r/min离心5 min，取上清，重复提取一次，合并上清液于恒温水浴锅浓缩至干燥；超声波提取30 min，3000 r/min离心5 min，取上清，重复提取一次，合并上清液于恒温水浴锅浓缩至干燥。

2.3 流动相选择

比较并筛选β-谷甾醇、山萘素和东茛菪内酯三种标准品溶液的不同流动相洗脱效果，各流动相详见表1。

表1 β-谷甾醇流动相筛选Table 1 Mobile phase screening forβ-sitosterol

2.4 上样量选择

取制备的β-谷甾醇、山萘素和东茛菪内酯三种提取液样品20μL、30μL、40μL、50μL，按“2.1标准曲线制作”方法分别进行色谱条件进样，记录峰面积，比较不同上样量对三种成分含量的影响。

2.5 三种成分含量计算

蝎子草中β-谷甾醇、山萘素、东茛菪内酯三种有效成分含量计算公式如下：

其中，G1：β-谷甾醇上样量，S1：β-谷甾醇上样体积，V1：10mL；G2：山萘素上样量，S2：山萘素上样体积，V2：5mL×25mL；G3：东茛菪内酯上样量，S3：东茛菪内酯上样体积，V3：5mL×25mL；M：蝎子草质量。

2.6 仪器精密度测定

取β-谷甾醇、山萘素、东茛菪内酯标准液，分别重复进样6次，测定峰面积，并计算三种成分的相对标准偏差。

2.7 供试品稳定性测定

取β-谷甾醇、山萘素和东茛菪内酯标准液，分别放置室温0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h后进样测定峰面积，并计算相对标准偏差。

3.1 三种标准品线性回归方程的建立

以上样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，分别得到β-谷甾醇线性回归方程y=295 674x-432 73(R2=99.93)，山萘素线性回归方程y=(7×106)x-213 804(R2=99.78)，东茛菪内酯线性回归方程y=(5×106)x+300 32(R2=99.97)。

3.2 三种有效成分提取方法比较

三种成分提取效果比较详见表2，β-谷甾醇超声波提取和索氏提取效果无差异（p=0.375），山萘素索氏提取效果显著高于超声波提取 （p＜0.001），东茛菪内酯超声波提取效果显著高于索氏提取（p＜0.001）。

表2 三种有效成分提取液HPLC色谱峰面积Table 2 The area of HPLC chromatogram of the three effective components

3.3 流动相优化

3.3.1 β-谷甾醇流动相选择

β-谷甾醇标准品9种流动相的高效液相色谱图峰面积及保留时间详见表3，当流动相为甲醇99%、甲醇-水（98.5∶1.5）、乙腈-水（97∶3）洗脱时，β-谷甾醇高效液相色谱图峰面积较大。

表3 β-谷甾醇标准品9种流动相色谱峰面积比较Table 3 Comparison of the chromatogram of 9 mobile phase for theβ-sitosterol standard compounds

以上3种流动相的高效液相色谱图详见图1（A、B、C）。当流动相为99%甲醇洗脱时，β-谷甾醇色谱图分离度较好，峰形尖锐对称；流动相为甲醇-水（98.5∶1.5/V∶V）洗脱时，不能对β-谷甾醇起到较好分的离效果；当流动相为乙腈-水（97∶3/V∶V）洗脱时，β-谷甾醇出峰过早，不利于目标物的检测。故确定选择99%甲醇为β-谷甾醇洗脱剂。

图1 β-谷甾醇不同流动相高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram with different mobile phase forβ-sitosterol

3.3.2 山萘素流动相选择

山萘素标准品6种流动相高效液相色谱图峰面积及保留时间详见表4，当流动相为甲醇-0.1%磷酸（62∶38/V∶V）、甲醇-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）、乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）、甲醇-0.5%磷酸（48∶52/V∶V）洗脱时，山萘素高效液相色谱图峰面积较大。

表4 山萘素标准品6种流动相色谱图比较Table 4 Comparison of the chromatogram of 6 mobile phase for the kaempferol standard compounds

以上4种流动相色谱图详见图2，由图2 A可以看出，当流动相为甲醇-0.1%磷酸（62∶38/V∶V）时，杂峰较多，对山萘素的分离效果较差；比较图2 B、C、D可以看出，当流动相为乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）时，山萘素色谱图峰面积最大，出峰时间早，无杂峰，分离效果较佳，故确定选择乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）作为山萘素的洗脱剂。

图2 山萘素不同流动相高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatogram with different mobile phase for kaempferol

3.3.3 东茛菪内酯流动相选择

茛菪亭标准品9种流动相高效液相色谱图峰面积及保留时间详见表5。当流动相为甲醇-水（60∶40/V∶V）、甲醇-水甲醇-水（75∶25/V∶V）、乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）、甲醇-0.85%磷酸（60∶40/V∶V）、甲醇-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）时，茛菪亭高效液相色谱图峰面积较大。

表5 茛菪亭标准品9种流动相色谱图比较Table 5 Comparison of the chromatogram of 9 mobile phase for the scopoletin standard compounds

以上5种流动相色谱图详见图3，甲醇水、乙腈磷酸及甲醇磷酸三类不同流动相对茛菪亭均有较好的分离效果，其中，乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）为流动相时，峰形最尖锐，出峰时间早，峰面积大，分离效果好，故确定选择乙腈-0.1%磷酸（65∶35/V∶V）作为东茛菪内酯的洗脱剂。

图3 茛菪亭不同流动相高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatogram with different mobile phase for scopoletin

3.4 方法学考察

3.4.1 精密度试验

β-谷甾醇、山萘素、东茛菪内酯标准品精密度试验结果详见表6，各成分峰面积的RSD依次为β-谷甾醇1.83%、山萘素1.52%、东茛菪内酯1.89%，均小于2%，表明仪器精密度良好。

表6 精密度试验结果（n=6）Table 6 The results of precision test

3.4.2 稳定性试验

β-谷甾醇、山萘素、东茛菪内酯标准品稳定性试验结果详见表7，将其分别放置0、2、4、6、8和10 h后测定峰面积，各成分RSD依次为β-谷甾醇1.38%、山萘素1.98%、东茛菪内酯1.79%，均小于2%，结果表明蝎子草β-谷甾醇、山萘素、东茛菪内酯提取液在室温下放置10 h后稳定性良好，满足试验所需。

表7 稳定性试验结果Table 7 The results of stability test

三种成分上样量及色谱图面积详见表8，随着上样量递增，各成分色谱图面积没有呈现良好的增长趋势，当上样量＞40μL，色谱峰杂乱，洗脱效果不佳，上样量与分离度成反比，过高的上样量不利于目标成分的检测，因此，上样量40μL较为适宜。

表8 三种成分不同上样量色谱峰面积比较Table 8 Comparison of chromatographic area of three components with different loading quantities

将待测样品β-谷甾醇、山萘素、东茛菪内酯提取液分别进行三次平行上样，得到三种有效成分平均含量依次为0.422 5 mg/g、0.099 3 mg/g和0.021 2 mg/g。

4 结论

β-谷甾醇、山萘素、东茛菪内酯为蝎子草发挥药理作用的三种重要化学成分。本研究采用HPLC法同时测定蝎子草中此三种物质的含量，并优化了其测定方法。试验建立的测定方法精密度高、稳定性好且快速简便，可为蝎子草药用成分含量检测及其合理用药提供参考依据。