葡萄多酚改善高脂饮食诱导的小鼠高血脂及对肠道菌群的调节作用

卢 烽，刘凤娇，胡小松，张 燕*

（1中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京 100083 2国家果蔬加工工程技术研究中心 北京 100083）

葡萄皮渣作为葡萄加工副产物，约占总重的20%，其中包含了葡萄中绝大部分的多酚物质，如葡萄皮中的主要多酚物质花色苷和籽中主要多酚物质原花青素等。众多研究表明，葡萄多酚物质具有改善心血管疾病，降血脂，抑制肝脏脂肪积累，缓解动脉粥样硬化等多种重要的生理活性[1-3]。此外，前人研究表明葡萄籽多酚降低血浆胆固醇的机制可能是通过与胆汁酸结合，抑制胰腺胆固醇酯酶而抑制胆固醇的吸收，并促进粪胆汁酸分泌[1]。葡萄多酚的降血脂作用虽然在分子水平上得到一定的论证，但其作用机理仍没有较为统一的答案，较多研究集中于对机体胆固醇和脂质代谢的影响方面。

肠道微生物作为一个庞大的群体得到越来越多的关注。近几年许多研究证实肠道微生物与机体代谢、疾病及炎症反应、免疫等密切相关，并且肠道微生物还能调节宿主胆固醇和脂质代谢等生理过程[4-6]。多酚物质的重要生理活性的发挥可能与其肠道微生物间的相互作用密切相关，一方面大量的体内、外代谢实验发现，人体摄入的多酚物质有90%～95%不能被吸收，而是直接到达结肠，被结肠微生物代谢成酚酸、醛、内酯等小分子物质；另一方面，多酚及其代谢产物会影响肠道微生物的生长、组成结构和功能性[7-10]。

多酚降血脂作用与其参与血脂相关合成、转运及代谢等过程的关联已有大量研究。然而，在多酚降血脂的过程中肠道微生物是否起作用，仍处于推测阶段。基于此，本文在前人研究的基础上，从肠道微生物的角度，对葡萄多酚的降血脂效果进行分析，探究其对胆固醇、脂质代谢及肠道微生物的影响，研究肠道微生物对于葡萄皮渣多酚降血脂的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄籽多酚提取物（GSE），天津尖峰科技，原花青素含量91.00%，总酚含量86.33%。

葡萄皮渣多酚纯化物（GPE），实验室自制，原花青素含量63.47%，总酚含量80.60%。

使用没食子酸当量计算总酚含量，使用儿茶酸当量计算原花青素含量。

高脂饲料：Research Diets D12492，251.15 kJ%，美国Research Diets 公司。

血清总胆固醇（TC）试剂盒（A111-1）、血清甘油三酯（TG）试剂盒（A110-1）、血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）试剂盒（A113-1）、血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）试剂盒（A112-1）、总胆汁酸（TBA）试剂盒（微板法），南京建成生物有限公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪（DR-200BS 型），无锡华卫德朗仪器有限公司；高速冷冻离心机（CR21G Ⅲ型），日本日立公司；多功能粉碎机（LBH-400Y），永康科徕尔有限公司；真空冷冻干燥机（LGJ-12），北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 GPE 的制备 巨峰葡萄（Vitis vinifera‘Kyoho’）经压榨后，收集皮渣，烘干，磨粉。室温下超声提取得到皮渣多酚粗提液，旋转蒸发除去有机溶剂，经AB-8 大孔吸附树脂柱层析纯化并真空冷冻干燥后，得到葡萄皮渣多酚纯化物（GPE），干燥密封保存待用。

1.3.2 实验动物及处理 实验动物：SPF 级雄性C57BL/6N 小鼠，6 周龄。所有实验动物处于同一环境，自由采食、采水，室内环境温度为（23±2）℃，相对湿度为（50±5）%，12 h 明暗循环。适应性饲养1 周后按体重将小鼠随机分为5 组，其中包括空白 组（Gro1）、高脂模型组（Gro2）、高脂GPE 组（Gro3）、高脂GSE 组（Gro4）。

按上述分组情况，每天定时按剂量对小鼠灌胃受试物 GPE（200 mg/kg）、GSE（200 mg/kg），空白组与高脂模型组灌胃生理盐水，连续8 周。每周称量体重，调整灌胃剂量。

1.3.3 血液采集 每2 周将小鼠禁食12 h 后断尾采血，高速冷冻离心（3 000 r/min，10 min），分离血清，-80 ℃存放待测。实验结束时，小鼠禁食12 h 后摘眼球采血，分离血清，-80 ℃分装保存。

1.3.4 组织采集 动物麻醉处死后，迅速摘取肝脏组织，用含冰的生理盐水快速漂洗组织样品，拭干，称重。取肝脏右叶部分制作肝冷冻切片，其余部分迅速进行液氮冷冻，于-80 ℃冰箱保存。

1.3.5 粪便收集 每2 周用代谢笼收集最后2 d喂食前的粪便，-80 ℃冻存，用于肠道微生物测序。

1.3.6 血清生化指标 血清指标血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血清LDL-c、血清 HDL-c均按照试剂盒说明进行操作，采用酶标仪测定。

1.3.7 血脂相关指数 按公式（1）～（3）计算血脂相关指数。

1.3.8 肝脏脂质测定 按试剂盒操作测定肝脏总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）。

1.3.9 肝脏组织病理学观察 取肝脏右叶1 块（1 cm×1 cm），立即置于10%的甲醛溶液中固定约24 h，经脱水、透明化和浸蜡处理后，制作冰冻切片，油红“O”染色，电子显微镜下观察肝组织病理学变化，染色后观察到的中性脂肪呈红色，细胞核呈淡蓝色。低倍镜下脂肪变性累计1/3～1/2 小叶肝细胞者为轻度；脂肪变性累计1/2～2/3 小叶肝细胞者为中度；脂肪变性累及2/3 以上小叶肝细胞者为重度。

1.3.10 粪便中胆汁酸的测定 代谢笼收集小鼠48 h 粪便，真空冷冻干燥机冻干。取100 mg 干粪便，加1 mL 蒸馏水，浸泡、匀浆，再加8 mL 甲醇，超声1 h，温度自然降至室温后，离心，取上清1 mL，用总胆汁酸试剂盒测定粪便中总胆汁酸浓度。

1.3.11 粪便微生物分析 选用德国QIAGEN 公司QIAamp®DNA Stool Mini Kit 试剂盒对样本的基因组DNA 进行提取，而后进行16S rDNA 高通量测序。取2.5 ng 稀释后的基因组DNA，以此作为模板，使用带有Barcode 的16S V4 通用引物（515F-806R），使用美国Promega 公司的GoTaqRHot Start Colorless Master Mix 高效高保真酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。

选用Miseq 平台对样本DNA 进行16S rDNA高通量测序；应用Mothur 进行分类操作单元（OTU）划分，将97%序列相似性作为标准，将这些序列划分为OTU，并按照序列数量生成OTU 丰度谱。基于OTU 丰度谱进行样本间的比较分析，研究不同分组样本的菌群特点。

1.4 统计学分析

所有数据均用SPSS 17 统计软件进行处理，采用单因素方差分析ANOVA，以Duncans 进行多重比较检验（Duncans multiple range tests）。实验分析结果以“平均值±标准差”（±s）表示，P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 体重变化情况

将各组间的体重进行比较，如表1所示。从第2 周开始，高脂模型组小鼠体重显著高于正常组，模型建成。高脂饮食小鼠连续灌胃GSE 1 周后体重开始显著降低，GPE 连续灌胃3 周后体重开始显著降低（P<0.05），且从第5 周开始，高脂GPE 组小鼠体重低于高脂GSE 组体重。可见，GPE 和GSE 均能够显著抑制高脂饮食引起的小鼠体重增加。这与前人研究结果一致，即葡萄多酚物质能降低体重，改善高脂饮食引起的肥胖[11]。

表1 GPE 和GSE 对高脂饮食小鼠体重的影响Table 1 Effects of GPE and GSE on the weight of high-fat diet mice

2.2 血清脂质变化情况

由表2可知，在整个实验过程中，高脂饮食小鼠的血清TG、TC、LDL-c 水平总体呈上升趋势，而HDL-c 水平呈下降趋势，即高脂饮食能够引起小鼠血浆脂质的紊乱。从第6 周开始，高脂模型组TG、TC、LDL-c 水平显著高于正常组，高血脂症模型建立。

结果表明，随着饲喂时间的延长，高脂饮食小鼠血清TG 呈上升趋势，通过葡萄多酚灌胃处理，TG 水平的升高得到一定抑制，其中GSE 干预6周后，TG 水平开始显著低于高脂模型组，GPE 灌胃8 周后对TG 也有一定的抑制效果，然而不显著，可能由于主要多酚物质原花青素在GPE 中的含量低于GSE。前人研究表明，葡萄多酚能够提高高脂饮食小鼠的脂蛋白脂酶（LPL）水平，促进TG水解，从而降低TG 水平[12]。葡萄籽多酚提取物通过活化法尼醇X 受体（FXR），提高小异二聚体伴侣受体（SHP）的表达，抑制脂肪酸和甘油三酯合成相关酶的关键转录因子SREBP-1C 的表达，降低餐后甘油三酯水平[13]。这与本文研究结果一致。

同样地，由表2可知，通过灌胃GPE 和GSE，在一定程度上抑制了高脂饮食引起的小鼠血清TC 水平的增加，GSE 在第8 周对血清TC 水平有显著降低效果，而GPE 灌胃8 周后血清TC 较高脂模型组无显著变化。研究表明，霞多丽葡萄籽粉喂食小鼠3 周能显著降低高脂饮食小鼠的血浆TC、LDL-c、VLDL-c 水平，而赤霞珠籽粉对血浆脂质无显著影响，表明葡萄籽粉的降血脂效果与其中含有的多酚物质种类和含量有关[14]。

LDL-c 为促动脉硬化因子，是高脂血症的重要判定依据之一。由表2可知，随着饲喂时间的延长，高脂饮食引起小鼠血清LDL-c 水平增加，从第6 周开始高脂模型组血清LDL-c 水平显著高于正常组。第8 周后GPE 和GSE 显著降低了血清LDL-c 水平。有研究表明膳食葡萄多酚摄入能活化肝细胞表面低密度脂蛋白受体（LDLR），诱导肝脏对血浆LDL-c 的代谢清除，从而降低血浆LDL-c 浓度[15]，这与本研究结果一致。

由表2可知，随着饲喂时间的延长，高脂模型组血清HDL-c 水平呈降低趋势，经灌胃GPE 和GSE 后，高脂饮食引起的血清HDL-c 降低得到一定程度的抑制，然而无显著性差异，与Kim 等[14]的研究结果一致。

表2 GPE 和GSE 对高脂饮食小鼠血脂的改善作用Table 2 The improving effects of GPE and GSE on the serum lipid of high-fat diet mice

总的来说，高脂饮食条件下，GPE 灌胃8 周显著降低了LDL-c 水平；GSE 灌胃8 周显著降低了TG、TC、LDL-c 水平，均表现出一定的降血脂效果。

2.3 血脂相关指数变化情况

高脂血症与动脉粥样硬化（AS）和心血管疾病（CHD）具有重要关联，通常为AS 与CHD 前期阶段的重要特征。为了综合比较AS 的发病倾向以及估计CHD 危险程度，常用AI、R-CHD、LCI 及HDL-c/TC 等血脂相关指数作为辅助诊断指标[16]。

由表3可知，实验8 周后，高脂模型组AI、RCHD、LCI 均显著高于正常组，而HGL-c/TC 显著低于正常组，即证实了高脂饮食会诱发高脂血症、AS 和CHD 的风险。GPE 和GSE 的干预显著降低了AI、R-CHD、LCI 指数，且显著提高了HDL-c/TC 指数，表明GPE 和GSE 能改善高脂饮食小鼠的脂质紊乱，对于AS 和CHD 的预防有重要意义。

表3 GPE 和GSE 对高脂饮食小鼠血脂相关指数的影响Table 3 The effects of GPE and GSE on the blood lipid related indices of high-fat diet mice

2.4 肝脏TC、TG 水平变化情况

肝脏为内源脂质合成和脂质代谢的主要场所。由表4可知，高脂饮食显著提高了小鼠肝脏TC 和TG 水平，而GPE 和GSE 对肝脏TC 和TG水平均表现出显著的降低效果，且以GSE 的影响最为明显，表明GPE 和GSE 能显著改善高脂饮食引起的小鼠肝脏脂质堆积，同时提示GPE 和GSE可能参与机体脂质代谢过程。有研究报道，葡萄皮多酚提取物可以降低肝脏脂肪积累，调节高脂饮食引起的小鼠肝脏脂代谢紊乱[17]。

表4 GPE 和GPE 对高脂饮食小鼠肝脂TC、TG 水平的影响Table 4 The effects of GPE and GSE on the liver TC and TG level of high-fat diet mice

2.5 肝脏脂肪沉积情况

电镜观察肝脏脂肪沉积情况如图1所示。正常组小鼠，染色呈阴性，未见明显的红染脂肪滴；高脂组，可见弥漫性大小不等的密集的桔红色圆形脂肪滴，呈“渔网”状；高脂GPE 组和高脂GSE组，可见弥漫性大小不等的红染脂肪滴，而相对于高脂组脂肪滴密度明显降低，说明GPE、GSE 对脂肪肝的积累、形成有一定的抑制效果，这与前人研究结果一致[17]。

图1 GPE 和GSE 对高脂饮食小鼠肝脏脂脂肪堆积的影响Fig.1 The effects of GPE and GSE on the hepatic lipid accumulation by oil red O（ORO） staining of high-fat diet mice

2.6 粪便总胆汁酸变化情况

胆汁酸与脂质代谢密切相关，95%的胆汁酸进行肝肠循环，余下部分通过粪胆汁酸形式排出。由表5可知，GPE 和GSE 对粪便总胆汁酸的分泌无显著影响。推测GPE 和GSE 葡萄复合多酚对粪便中胆汁酸的影响主要体现在对初级、次级胆汁酸种类上的影响，这还需要进一步的实验验证。

表5 GPE 和GPE 对粪便总胆汁酸的影响Table 5 The effects of GPE and GSE on the liver total bile acid in feces of high-fat diet mice

2.7 葡萄多酚对肠道菌群的干预

采用动物肠道微生物模型进一步研究葡萄多酚对高脂饮食下肠道菌群的影响。由图2a 可知，在门水平上，样本菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、变形菌门（Proteobacteria）四大菌门构成。高脂饮食能增加变形菌门的丰度，灌胃GPE则增加了疣微菌门的相对丰度。

肠道菌群属水平的平均值如图2b 所示，GPE明显增加了未分类肠杆菌科菌属（Unclassified Enterobacteriaceae）、艾克曼菌属（Akkermansia）、副杆菌属（Parabacteroides）等菌属的相对丰度，降低了未分类瘤胃菌科菌属（Unclassified Ruminococcaceae）、乳杆菌属（Lactobacillus）等菌属的相对丰度。GSE 明显增加未分类瘤胃菌科菌属（Unclassified Ruminococcaceae）、副杆菌属（Parabacteroides）等菌属的相对丰度，明显降低了布劳特氏菌属（Blautia）、乳杆菌属（Lactobacillus）等菌属的相对丰度。

图2 肠道菌群门和属的平均值Fig.2 Average value of phylum and genus of gut microbiota

应用LEfSe 分析比较了不同组间的差异菌。图1比较了空白组与高脂模型组的菌群差异物种。这2 组的菌群差异主要是由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门中的菌属所引起。具体而言，在空白组所有检测到的12 种关键菌属中，副杆菌属（Parabacteroides）、普雷沃氏菌属（Prevotellaceae）、普氏菌属（Prevotella）、紫单胞菌属（Porphyromonadaceae）等几个拟杆菌门的菌属以及厚壁菌门的布劳特氏菌属（Blautia）占比较高。而高脂组检测到了18 个关键菌属，其中厚壁菌门梭菌纲的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、朊细菌门的脱硫弧菌属（desulfovibrionaceae）、厚壁菌门的乳球菌属（Lactococcus）等菌属所占比例较高。

副杆菌属（Parabacteroides）的一些种类能显著减轻由硫酸钠葡聚糖（DSS）引起的急慢性结肠炎[18]。普氏菌属（Prevotella）是肠道中发酵的重要细菌，能改善糖代谢，提升血糖控制[19-20]。布劳特氏菌属（Blautia）产生短链脂肪酸，并与肥胖成负相关[21]。紫单胞菌属与肝脏中TNF-α 的表达成负相关，并且紫单胞菌属的减少也许会加重肝脏炎症[22]。这些有益菌属的相对丰度在高脂组中明显低于空白组。此外，有文献报道高脂诱导的肥胖小鼠中厚壁菌门/拟杆菌门高于正常小鼠[23]，这与本实验结果一致，并且高脂组小鼠变形菌门相对丰度显著高于空白组。变形菌门中包含多种致病菌，并且多为革兰氏阴性菌，是产生脂多糖（LPS）的来源，脂多糖会导致内毒素血症，加重炎症、肥胖和胰岛素抵抗。

图4结果显示的是高脂模型组（Gro2）、高脂GPE 组（Gro3）、高脂GSE 组（Gro4）之间有差异的物种。这3 组的菌群差异主要是由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门中的菌属所引起。具体而言，在高脂组所有检测到的21 种关键菌属中，厚壁菌门的乳杆菌属（Lactobacillus）、放线菌门的土壤球菌属（Agrococcus）、朊细菌门的脱硫弧菌属（Desulfovibrionaceae）的相对丰度较大。而GPE 组检测到了26 个关键菌属，其中丹毒丝菌属（Erysipelotrichaceae）、乳球菌属（Lactococcus）等几个属于厚壁菌门的菌属所占比例较大。GSE 组检测到了37 个关键菌属，其中厚壁菌门的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）作用最大，并且GSE 的关键菌种以梭菌、拟杆菌居多。

图4 LEfSe 分析高脂模型组（Gro2）、高脂GPE 组（Gro3）、高脂GSE 组（Gro4）之间肠道菌群差异Fig.4 LEfSe analysis the differences among the gut microbiota of high-fat diet model group（Gro2）,GPE high-fat diet group（Gro3）and GSE high-fat diet group（Gro4）

GPE 干预组中艾克曼菌属（Akkermansia）显著高于其它组。有研究报道艾克曼菌属与肥胖呈负相关，可抑制高脂饮食引起的脂代谢紊乱[23]。实验结果指出高脂组颤螺旋菌属（Oscillibacter）丰度显著高于GPE 组。有研究指出该菌丰度同肥胖呈正相关，且高脂饮食会诱导它的丰度增加[24]。GSE组的未分类瘤胃菌科菌属（Unclassified Ruminococcaceae）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）明显高于高脂组。未分类瘤胃菌科菌属（Unclassified Ruminococcaceae）与体重降低、增加能量代谢呈正相关，并且会促进纤维素的代谢[25]。此外有文献报道瘤胃菌科（Ruminococcaceae）与体重降低、能量代谢增加呈正相关，且对纤维素的代谢有明显促进作用[26-27]。GSE 组中嗜胆菌属（Bilophila）显著高于高脂组，它能减少肝脏脂肪的渗透，并且与糖尿病的减轻呈正相关[28-29]。

图3 LEfSe 分析正常组（Gro1）与高脂组（Gro2）小鼠肠道菌群差异Fig.3 LEfSe analysis the differences between the gut microbiota of control group（Gro1）and high-fat diet model group（Gro2）

3 结论

本研究通过动物实验探究了葡萄多酚降血脂的效果，并探讨了葡萄多酚降血脂功能与肠道菌群相关的作用机制。发现葡萄皮渣多酚提取物（GPE）和葡萄籽多酚提取物（GSE）均能显著抑制高脂饮食下小鼠的体重增加。并且GPE 能显著降低LDL-c 水平；GSE 则可显著降低TG、TC、LDL-c水平。因此，GPE 和GSE 有抑制高血脂的作用。此外，本实验应用肠道菌群测序进一步分析了葡萄多酚对高脂饮食小鼠肠道微生物的改善作用，发现GPE 和GSE 可以增加一些有利于降血脂的肠道菌的相对丰度。

然而，GPE 与GSE 的调节脂质代谢紊乱与肠道菌群效果并不完全一致，而且肠道菌群在葡萄多酚降血脂过程中的具体作用尚不清楚，还需要继续深入研究。