高产生物膜乳酸菌的筛选、鉴定及胞外多糖分泌条件的研究

钟华晨，张 悦，顾 悦，郑砚学，纪亚楠，王 艳，贺银凤*

（1内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特 010018 2内蒙古农牧业科学院资源环境与检测技术研究所 呼和浩特 010031）

乳酸菌作为一种重要的益生菌，在工业、农牧业、医药和食品等与人类生活密切相关的领域应用广泛，然而，当乳酸菌的生存条件发生改变时，其存活率也会受到影响，进而可能导致其功能改变或丧失[1-2]。经过长期的探索，人们发现当乳酸菌以被膜态生长时，能够增强其抵抗外界不良环境影响的能力，而且自然界存在的大部分乳酸菌属于有益菌，高产生物膜的乳酸菌可以更好地发挥其益生功能，对其应用于各个领域具有重要意义[3-4]。

乳酸菌生物膜是乳酸菌包埋在自身产生的胞外多聚物的基质上，不可逆地附着在载体表面，显示出与游离细胞不同表型的一种菌落聚集体。胞外多聚物主要包括胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）、蛋白质和胞外DNA 等，EPS 是乳酸菌在繁殖代谢过程中分泌出的水溶性大分子糖类物质，在生物膜的形成过程中必不可少，能够和蛋白质共同维持生物膜的结构及其稳定性[5-6]。

乳酸菌的EPS 产量越高，预示着其产生物膜的能力越强。在相同的培养条件下，不同培养基组分，如碳源、氮源和无机盐等都会对乳酸菌EPS 产量造成一定影响。有研究发现，在培养基中添加不同种类及不同浓度的碳源，乳酸菌产EPS 量会发生改变，植物乳杆菌70810 以蔗糖为碳源时EPS的生成量达到最大值[7]，德氏乳杆菌保加利亚亚种G1EPS 最大生成量的最适碳源为葡萄糖[8]，乳酸菌Z22 以葡萄糖为碳源时EPS 的生成量达到最大[9]。氮源缺乏会导致菌体生长量和EPS 的积累量降低，将乳清蛋白酶解物添至乳清培养基中能够促进保加利亚乳杆菌RR 的生长，并提高EPS 的合成量[10]。有研究表明当胰蛋白胨和蛋白胨质量比为2∶1 时，乳酸菌SR2-2 EPS 的产量达到最大值[11]。无机盐、维生素和氨基酸等营养成分对乳酸菌EPS 的产量也会造成一定影响[12]，添加无机盐可以提高植物乳杆菌C83 EPS 的合成量[13]，在乳清培养基中添加无机盐和氨基酸后，鼠李糖乳杆菌RW-9595M EPS 的合成量明显提高[14]，然而对保加利亚乳杆菌NCFB 2772 来说，将无机盐和维生素添加在培养基中，EPS 的产量没有明显变化[15]，说明菌株之间的差异性导致提高EPS 产量所需的营养条件不同。

乳酸菌在人体内具有良好的益生功能，当乳酸菌以生物膜的状态存在时，可以有效抵御外界不良环境，确保菌体正常生长。EPS 是生物膜的主要成分，研究乳酸菌EPS 的分泌，对于进一步提高乳酸菌生物膜的生成量，增加代谢产物的利用，具有重要意义。本研究以前期分离出的乳酸菌为研究对象，筛选和鉴定高产生物膜的乳酸菌。以提高乳酸菌生物膜的主要成分EPS 的合成量为目标，优化培养基成分，为后续研究乳酸菌抵抗环境胁迫和机体免疫防御功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

课题组前期从西藏不同地区的发酵乳制品中，在30 ℃下分离得到20 株，37 ℃下分离得到21 株，共41 株乳酸菌，具体编号及来源见表1。

表1 菌株编号及来源Table 1 Number of strains and strain source

主要试剂：Premix Taq Mix、DL2000 DNA Marker、6×Loading buffer，宝生物工程有限公司；Gel View 核酸染料，TaKaRa 公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，天根生化科技有限公司；其余试剂均为分析纯级。

1.2 培养基与主要仪器

MRS 培养基参照文献[16]配制。

脱脂乳培养基：在10%脱脂乳水溶液中加入0.1%酵母提取粉，115 ℃高压灭菌7 min，冰水激冷。

GelDoc XR+凝胶成像仪，美国Bio-Rad 公司；Veriti96 孔快速梯度PCR 仪，美国ABI 公司；超微量蛋白核酸分析仪，英国BioDrop 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化、纯化与保藏 对课题组前期分离出的41 株乳酸菌冻干粉用10%的脱脂乳活化一代，待脱脂乳凝乳后再用普通MRS 培养基继续活化24 h，然后倒平板划线培养48 h，挑取单菌落通过革兰氏染色法确定菌株形态后，将乳酸菌在MRS 培养基中活化24 h，以4∶1 的体积比混合菌液和甘油于1.5 mL 离心管中，置于-80 ℃冰箱保藏。

1.3.2 供试菌液的制备 将甘油保存的试验菌株按2%的体积分数接种于MRS 液体培养基中，37℃或30 ℃活化二代，将活化好的二代培养液以4 000 r/min 的速率离心10 min（4 ℃）后，弃掉上清液，用灭菌的PBS 洗涤3 次后调节菌浓度至108CFU/mL（OD595nm值为1.0）制成供试菌液[17]。

1.3.3 具有成膜能力乳酸菌的筛选 采用结晶紫染色法测定生物膜的生成量。将供试菌液以2%的体积分数接种于新的MRS 培养基中，以每孔200 μL 加入至96 孔细胞培养板，37 ℃或30 ℃静置培养，培养后弃上层发酵液，用灭菌的0.85%生理盐水清洗细胞培养板，洗去未成膜的浮菌；待板晾干后，加入10%甲醇溶液固定细胞10 min，弃甲醇；待板晾干后，加1%结晶紫染液染色20 min，弃染液，用灭菌的PBS 洗涤3 次；待板晾干后，加33%醋酸溶液脱色10 min，测定波长595 nm 处的吸光值[18]。试验时间为0～25 h，从4 h 开始每隔3 h 取样进行生物膜生成量的测定。

1.3.4 高产生物膜乳酸菌16S rDNA 序列的测定将1.3.3 节中筛选得到的高产生物膜乳酸菌用DNA 提取试剂盒提取每株菌的总DNA；通过超微量蛋白核酸分析仪测定其DNA 浓度。以提取出的DNA 作为模板，选用16S rDNA 通用引物（表2）进行PCR 扩增，扩增条件为：预变性5 min，94 ℃；94 ℃变 性1 min，64 ℃退 火1 min，72 ℃延 伸2 min；4 ℃延伸10 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，若1 500 bp 处有清晰、明亮的扩增条带，无非特异性产物，表明PCR 扩增成功；委托上海生工有限公司对PCR 产物测序分析，利用NCBI 数据库BLAST 将菌株的16S rDNA 序列与GenBank 数据库中已登录的序列进行比较，使用DNAStar 中MegAlign 软件构建菌株系统发育树。

表2 通用引物序列Table 2 Universal primer sequences

1.4 乳酸菌EPS 的粗提取

将活化三代的10 mL 发酵液以8 000 r/min 离心5 min，弃菌泥，将质量浓度为0.8 g/mL 的三氯乙酸加入无细胞上清发酵液中，使其终质量浓度为0.04 g/mL，4 ℃静置24 h，10 000 r/min 离心20 min，除去蛋白质，收集上清液，加入3 倍体积95%的冰乙醇，4 ℃静置24 h，沉淀多糖后，10 000 r/min 离心20 min，收集沉淀（红色），超纯水等体积溶解后进行24 h 透析（中间换水4～6 次），即得到粗多糖。

1.5 培养基成分对乳酸菌EPS 形成的影响

1.5.1 碳源的筛选 以MRS 培养基作为基础培养基，将其中的葡萄糖用20.0 g/L 蔗糖、乳糖、麦芽糖和半乳糖替代，将供试菌液以2%体积分数接种于添加不同碳源的MRS 培养基中，37 ℃或30℃静置培养24 h，按照1.4 节的方法提取粗多糖，并用苯酚硫酸法测定其EPS 含量，结合菌体生长量选择最佳碳源。

在确定出最佳碳源种类的基础上，分别添加0.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0 g/L 碳源，筛选出最佳的碳源质量浓度。

1.5.2 氮源的筛选 以MRS 培养基作为基础培养基，将其中的大豆蛋白胨用10.0 g/L 胰蛋白胨、蛋白胨和硫酸铵替代，将供试菌液以2%的体积分数接种于添加不同碳源的MRS 培养基中，37 ℃或30 ℃静置培养24 h，按照1.4 节的方法提取粗多糖，并用苯酚硫酸法测定其EPS 含量，结合菌体生长量选择最佳氮源。

在确定出最佳氮源种类的基础上，分别添加0.0，5.0，10.0，15.0，20.0 g/L 氮源，筛选出最佳的氮源质量浓度。

1.5.3 磷酸盐筛选 将供试菌液以2%的体积分数接种于不同质量浓度磷酸氢二钾（0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 g/L）的MRS 培养基中，37 ℃或30 ℃静置培养24 h，按照1.4 节的方法提取粗多糖，并用苯酚硫酸法测定其EPS 含量，结合菌体生长量确定出最佳磷酸氢二钾的质量浓度。

1.5.4 正交试验设计 见表3。

表3 乳酸菌EPS 最佳培养基成分正交设计水平因素表Table 3 Orthogonal design level and factor for the medium composition of LAB EPS

1.6.5 数据处理及分析 每组试验重复3 次，用SPSS 23.0 对试验数据进行统计分析，所有数值用“平均值±标准差”表示，P<0.05。

2 结果与分析

2.1 高产生物膜菌株的筛选结果

将41 株乳酸菌用96 孔板培养4，7，10，13，16，19，22，25 h，通过结晶紫染色法测定生物膜生成量，试验结果见表4、5。

由表4可知，在37 ℃条件下培养21 株乳酸菌，在13 h 生物膜产量达到最高，此时乳酸菌大都处于对数末期和稳定期，增值数与死亡数达到平衡，并产生相应的代谢产物，同时生物膜累积量也达到最高。随着培养时间的延长，营养成分被大量消耗，菌株生长速率逐渐降低，生物膜生成量也随之降低，由于部分浮游菌株会重新定植于载体表面，生物膜积累量会再次升高。由表5可知，在30 ℃条件下培养乳酸菌，大部分乳酸菌在16 h 时生物膜积累量最多，此时菌株处于稳定期生长速率达到动态平衡，代谢产物大量积累。综上所述，生物膜的形成是先上升后下降再逐渐上升的过程。

25 0.166 ± 0.018 0.259 ± 0.018 0.244 ± 0.005 0.240 ± 0.005 0.141 ± 0.023 0.191 ± 0.025 0.175 ± 0.005 0.148 ± 0.002 0.162 ± 0.015 0.170 ± 0.007 0.154 ± 0.028 0.146 ± 0.025 0.378 ± 0.016 0.142 ± 0.015 0.211 ± 0.008 0.121 ± 0.011 0.133 ± 0.011 0.226 ± 0.008 0.189 ± 0.010 0.174 ± 0.024 0.287 ± 0.016），n=3 ˉ±s（x量成生膜物生的间时同不在菌酸乳的养培并离分下37 ℃4表），n=3（images/BZ_103_1816_2946_1842_2988.png±s at different times Biofilm production of lactic acid bacteria isolated and cultured at 37 ℃Table 4 /h间时养培22 19 16 13 10 7 4 0.185 ± 0.007 0.205 ± 0.022 0.308 ± 0.036 0.413 ± 0.028 0.246 ± 0.013 0.118 ± 0.011 0.162 ± 0.020 0.242 ± 0.021 0.254 ± 0.023 0.268 ± 0.024 0.504 ± 0.036 0.396 ± 0.009 0.223 ± 0.008 0.283 ± 0.046 0.320 ± 0.019 0.234 ± 0.015 0.180 ± 0.016 0.530 ± 0.026 0.272 ± 0.020 0.166 ± 0.037 0.127 ± 0.015 0.302 ± 0.021 0.263 ± 0.011 0.343 ± 0.036 0.669 ± 0.018 0.386 ± 0.053 0.241 ± 0.023 0.324 ± 0.078 0.223 ± 0.006 0.132 ± 0.031 0.200 ± 0.038 0.439 ± 0.049 0.253 ± 0.033 0.205 ± 0.004 0.130 ± 0.040 0.221 ± 0.031 0.141 ± 0.008 0.194 ± 0.023 0.506 ± 0.026 0.356 ± 0.037 0.218 ± 0.017 0.193 ± 0.020 0.214 ± 0.018 0.154 ± 0.023 0.169 ± 0.039 0.463 ± 0.009 0.289 ± 0.039 0.183 ± 0.009 0.145 ± 0.012 0.240 ± 0.008 0.138 ± 0.015 0.208 ± 0.040 0.531 ± 0.011 0.387 ± 0.036 0.223 ± 0.014 0.108 ± 0.017 0.145 ± 0.006 0.134 ± 0.023 0.168 ± 0.028 0.589 ± 0.018 0.341 ± 0.049 0.241 ± 0.054 0.153 ± 0.036 0.230 ± 0.008 0.210 ± 0.031 0.180 ± 0.019 0.691 ± 0.014 0.336 ± 0.008 0.376 ± 0.026 0.201 ± 0.031 0.188 ± 0.025 0.229 ± 0.018 0.237 ± 0.021 0.316 ± 0.039 0.291 ± 0.010 0.115 ± 0.031 0.174 ± 0.038 0.202 ± 0.031 0.215 ± 0.023 0.219 ± 0.012 0.366 ± 0.037 0.286 ± 0.044 0.143 ± 0.009 0.233 ± 0.035 0.373 ± 0.034 0.279 ± 0.017 0.330 ± 0.012 0.487 ± 0.052 0.394 ± 0.054 0.250 ± 0.039 0.305 ± 0.047 0.153 ± 0.010 0.125 ± 0.012 0.272 ± 0.017 0.473 ± 0.047 0.373 ± 0.023 0.118 ± 0.003 0.154 ± 0.041 0.340 ± 0.033 0.233 ± 0.012 0.337 ± 0.008 0.521 ± 0.032 0.509 ± 0.043 0.227 ± 0.006 0.276 ± 0.010 0.161 ± 0.014 0.137 ± 0.021 0.257 ± 0.026 0.541 ± 0.081 0.368 ± 0.023 0.170 ± 0.034 0.163 ± 0.032 0.193 ± 0.006 0.115 ± 0.017 0.202 ± 0.024 0.439 ± 0.070 0.316 ± 0.011 0.189 ± 0.046 0.130 ± 0.040 0.311 ± 0.030 0.210 ± 0.024 0.344 ± 0.029 0.646 ± 0.004 0.392 ± 0.042 0.265 ± 0.033 0.213 ± 0.004 0.208 ± 0.023 0.191 ± 0.031 0.515 ± 0.002 0.637 ± 0.024 0.448 ± 0.047 0.243 ± 0.049 0.134 ± 0.010 0.210 ± 0.031 0.140 ± 0.002 0.223 ± 0.036 0.641 ± 0.044 0.363 ± 0.032 0.253 ± 0.074 0.138 ± 0.041 0.239 ± 0.024 0.209 ± 0.033 0.296 ± 0.003 0.628 ± 0.014 0.412 ± 0.027 0.318 ± 0.060 0.188 ± 0.053称名株菌号序RJ2-1-8 1 RJ1-1-8 2 TZ3-1-4 3 RM3-1-4 4 RM3-1-11 5 TG12-1-1 6 RJ2-1-9 7 RM3-1-3 8 RJ2-1-1 9 RJ2-1-4 10 RJ1-1-10 11 TG3-1-2 12 RM3-1-2 13 TZ3-1-1 14 RM1-1-1 15 RJ2-1-2 16 TG9-1-3 17 TG1-1-10 18 RJ1-1-4 19 TG1-1-11 20 RM2-1-5 21

25 0.209 ± 0.020 0.282 ± 0.021 0.349 ± 0.043 0.232 ± 0.019 0.321 ± 0.046 0.217 ± 0.021 0.210 ± 0.020 0.126 ± 0.024 0.138 ± 0.042 0.673 ± 0.030 0.222 ± 0.020 0.208 ± 0.017 0.408 ± 0.021 0.268 ± 0.039 0.253 ± 0.017 0.372 ± 0.024 0.246 ± 0.016 0.215 ± 0.038 0.270 ± 0.034 0.265 ± 0.039），n=3（images/BZ_103_1816_2946_1842_2988.png±s量成生膜物生间时同不在菌酸乳的养培并离分下30 ℃5表），n=3（images/BZ_103_1816_2946_1842_2988.png±s at different times Biofilm production of lactic acid bacteria isolated and cultured at 30 ℃Table 5 /h间时养培22 19 16 13 10 7 4 0.307 ± 0.047 0.125 ± 0.003 0.255 ± 0.051 0.262 ± 0.028 0.126 ± 0.017 0.163 ± 0.016 0.165 ± 0.036 0.291 ± 0.025 0.178 ± 0.033 0.334 ± 0.021 0.181 ± 0.009 0.227 ± 0.038 0.181 ± 0.013 0.210 ± 0.019 0.319 ± 0.020 0.351 ± 0.039 0.478 ± 0.005 0.455 ± 0.031 0.432 ± 0.013 0.423 ± 0.020 0.367 ± 0.029 0.264 ± 0.011 0.163 ± 0.036 0.258 ± 0.020 0.215 ± 0.024 0.155 ± 0.036 0.215 ± 0.020 0.195 ± 0.036 0.152 ± 0.028 0.163 ± 0.040 0.163 ± 0.026 0.218 ± 0.048 0.141 ± 0.034 0.228 ± 0.021 0.200 ± 0.066 0.216 ± 0.020 0.322 ± 0.033 0.283 ± 0.029 0.178 ± 0.007 0.184 ± 0.007 0.239 ± 0.035 0.175 ± 0.020 0.120 ± 0.005 0.260 ± 0.033 0.238 ± 0.013 0.224 ± 0.004 0.083 ± 0.010 0.208 ± 0.018 0.168 ± 0.035 0.185 ± 0.010 0.230 ± 0.035 0.203 ± 0.010 0.125 ± 0.029 0.093 ± 0.009 0.253 ± 0.022 0.208 ± 0.008 0.167 ± 0.008 0.104 ± 0.014 0.209 ± 0.012 0.124 ± 0.005 0.114 ± 0.025 0.183 ± 0.031 0.099 ± 0.017 0.700 ± 0.039 0.729 ± 0.034 0.771 ± 0.016 0.660 ± 0.029 0.563 ± 0.026 0.639 ± 0.017 0.603 ± 0.041 0.378 ± 0.023 0.177 ± 0.024 0.281 ± 0.036 0.177 ± 0.024 0.184 ± 0.013 0.205 ± 0.035 0.173 ± 0.006 0.187 ± 0.015 0.156 ± 0.035 0.237 ± 0.036 0.142 ± 0.013 0.153 ± 0.031 0.191 ± 0.016 0.164 ± 0.038 0.325 ± 0.027 0.258 ± 0.037 0.487 ± 0.032 0.272 ± 0.031 0.146 ± 0.021 0.199 ± 0.050 0.152 ± 0.020 0.229 ± 0.026 0.162 ± 0.021 0.408 ± 0.018 0.186 ± 0.037 0.118 ± 0.028 0.163 ± 0.039 0.181 ± 0.031 0.151 ± 0.032 0.144 ± 0.029 0.340 ± 0.031 0.142 ± 0.030 0.111 ± 0.016 0.146 ± 0.016 0.188 ± 0.032 0.239 ± 0.033 0.359 ± 0.033 0.704 ± 0.067 0.444 ± 0.031 0.367 ± 0.038 0.359 ± 0.042 0.411 ± 0.012 0.119 ± 0.029 0.226 ± 0.026 0.344 ± 0.027 0.157 ± 0.026 0.106 ± 0.022 0.152 ± 0.020 0.103 ± 0.014 0.226 ± 0.017 0.214 ± 0.026 0.319 ± 0.019 0.138 ± 0.026 0.127 ± 0.028 0.249 ± 0.039 0.124 ± 0.014 0.142 ± 0.032 0.107 ± 0.011 0.351 ± 0.028 0.120 ± 0.019 0.125 ± 0.026 0.209 ± 0.005 0.122 ± 0.022 0.08 ± 0.006 0.212 ± 0.020 0.443 ± 0.014 0.128 ± 0.010 0.157 ± 0.011 0.163 ± 0.027 0.108 ± 0.009称名株菌号序TG2-1-5 1 TG5-1-6 2 TG7-1-6 3 TG7-1-4 4 RS1-1-2 5 TG12-1-6 6 RM1-1-20 7 TG12-1-5 8 RM2-1-19 9 TG7-1-1 10 TG7-1-3 11 TG3-1-19 12 TG5-1-5 13 RM3-1-7 14 RQ1-1-2 15 RM1-1-4 16 TG11-1-10 17 TG8-1-9 18 TG2-1-14 19 TZ1-1-13 20

通过比较不同菌株生物膜的最大生成量，筛选高产生物膜的乳酸菌用于后续试验，结果如图1和图2所示。

图1 21 株乳酸菌在13 h 生物膜生成量Fig.1 Biofilm production of 21 strains of LAB 13 hours

图2 20 株乳酸菌在16 h 生物膜生成量Fig.2 Biofilm production of 20 strains of LAB 16 hours

由图1可知，将菌株在37 ℃培养13 h 后采用结晶紫染色法测定生物膜生成量，其中RM3-1-4、RJ2-1-4、TG1-1-10、RJ1-1-4、TG1-1-11、RM2-1-5 共6 株乳酸菌的成膜量显著高于其它菌株；由图2可知，将菌株在30 ℃培养16 h 后采用结晶紫染色法测定生物膜生成量，其中TG7-1-1、RM1-1-4、TG5-1-5、TG7-1-6 4 株乳酸菌的成膜量显著高于其它菌株。因此，选取以上10 株高产生物膜的乳酸菌进行后续益生特性研究。

2.2 高产生物膜乳酸菌的鉴定

2.2.1 乳酸菌16S rDNA 扩增结果 对高产生物膜的10 株乳酸菌进行分子生物学鉴定。10 株菌的DNA 经16S rDNA PCR 扩增产物电泳见图3。10 株高产生物膜的乳酸菌在1 500 bp 处条带清晰明亮，无非特异性扩增现象，符合测序要求。

图3 乳酸菌16S rDNA 基因PCR 扩增产物电泳图Fig.3 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA gene fragments from LAB

2.2.2 系统发育树及同源性分析 将10 株高产生物膜乳酸菌的基因序列与Gene Bank 中菌株16S rRNA 基因序列相比较，同源性分析结果见图4。系统发育树见图5。

图5 试验菌株系统发育树Fig.5 Phylogentic tree of test strains

由图4、5 可知，乳酸菌RM1-1-4、TG1-1-10、RJ2-1-4、TG1-1-11 和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）NGRI 0510Q 同源性分别为99.5%，98.1%，99.7%，98.4%且属于同一分支，乳酸菌RJ1-1-4 和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）JCM 1149 同源性为99.6%且属于同一分支，乳酸菌TG7-1-1 和乳酸乳球菌（Lactococcus lictis）NBRC100933 同源性为99.5%且属于同一分支，乳酸菌TG7-1-6 和乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp.cremoris）NBRC 100676 同源性为97.6%且属于同一分支，乳酸菌RM3-1-4、RM2-1-5 和坚韧肠球菌（Enterococcus durans）NBRC 100479 同源性分别为98.6%和99.1%且属于同一分支，乳酸菌TG5-1-5 和肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）JCM 6124 同源性为99.5%且属于同一分支。

图4 试验菌株与其它乳酸菌的同源性分析Fig.4 The homology analysis between the test strain and knowns LABs

综上所述，乳酸菌RM1-1-4、TG1-1-10、RJ2-1-4、TG1-1-11 为乳酸片球菌，RJ1-1-4 为植物乳杆菌，TG7-1-1 为乳酸乳球菌，TG7-1-6 为乳酸乳球菌乳脂亚种，RM3-1-4、RM2-1-5 为坚韧肠球菌，TG5-1-5 为肠膜明串珠菌。

对筛选出的10 株高产生物膜菌株进行潜在益生特性的测定，最终选择具有良好潜在益生特性的乳酸片球菌RJ2-1-4 进行后续试验。

2.3 不同培养基成分对乳酸菌EPS 产量的影响

2.3.1 碳源种类及浓度对乳酸菌EPS 产量的影响碳源是菌株生长繁殖所必需的营养物质，能为细胞合成产物提供碳架[19]。不同菌株的碳水化合物代谢酶系统不同，所以不同的碳源种类及浓度对菌株的生长及代谢有很大的影响，本试验旨在提高乳酸菌EPS 的产量进而提高生物膜产量，因此要对碳源进行筛选，以找到最佳碳源，不同碳源种类见图6。

图6 不同碳源种类对菌株RJ 2-1-4 EPS 的影响Fig.6 Effects of different carbon sources on the EPS of RJ 2-1-4

在MRS 培养基中添加不同种类的碳源，37℃静置培养24 h，用苯酚硫酸法测定菌株EPS 的产量。由图6可知，菌株RJ2-1-4 在以葡萄糖为碳源时，EPS 的产量最大，其次是乳糖、蔗糖、麦芽糖，以半乳糖为碳源时EPS 的产量最低。综上所述，葡萄糖为菌株RJ2-1-4 高产EPS 的最佳碳源，不同葡萄糖浓度对菌株RJ2-1-4 的EPS 合成量的影响结果见图7。

由图7可知，随着葡萄糖质量浓度的升高，菌株RJ2-1-4 EPS 的产量逐渐升高，与对照组（葡萄糖质量浓度为20 g/L） 相比较，质量浓度为30 g/L 时，菌株RJ2-1-4 EPS 产量显著增加，且产量达到最大值。当葡萄糖质量浓度继续升高时，EPS产量有所减少，可能是由于高质量浓度的葡萄糖会导致菌株RJ2-1-4 细胞渗透压过大，对菌株产EPS 有抑制作用。同时随着葡萄糖质量浓度的增加，菌株生长量也逐渐增加，当葡萄糖质量浓度达到50 g/L 时，菌株生长量明显下降，可能由于高质量浓度的碳源会抑制菌株生长，这与陈媛等[20]的研究结果一致。因此选择30 g/L 作为乳酸片球菌RJ2-1-4 高产EPS 的最佳碳源质量浓度。

图7 不同葡萄糖质量浓度对菌株RJ2-1-4 EPS 的影响Fig.7 Effect of different glucose mass concentration on EPS of RJ2-1-4

2.3.2 氮源种类及浓度对乳酸菌EPS 产量的影响氮源能够为菌体生长繁殖提供氮素，组成菌体蛋白质、核酸及其它含氮代谢物[21]。本试验选用大豆蛋白胨、普通蛋白胨、胰蛋白胨和硫酸铵作为氮源，考察不同氮源对菌株RJ2-1-4 EPS 合成量的影响，以筛选出最佳氮源种类，将最佳氮源以不同浓度添加到MRS 培养基中，37 ℃静置培养24 h测定乳酸菌RJ2-1-4 EPS 的产量，进一步确定最佳氮源浓度，具体结果见图8、9。

由图8可知，以大豆蛋白胨为主要氮源时，菌株RJ2-1-4 EPS 的合成量最高，其次是普通蛋白胨和胰蛋白胨，以硫酸铵作为主要氮源时产生EPS 最少，因此选择大豆蛋白胨作为最佳氮源。不同大豆蛋白胨质量浓度对菌株RJ2-1-4 EPS 合成量的影响结果见图9。

图8 不同氮源种类对菌株RJ2-1-4 EPS 的影响Fig.8 Effects of different nitrogen sources on the EPS of RJ2-1-4

以大豆蛋白胨作为主要氮源，添加质量浓度为0，5，10，15，20 g/L 的大豆蛋白胨于MRS 培养基中，37 ℃静置24 h 测定菌株EPS 的产量。由图9可知，在大豆蛋白胨的质量浓度为0～15 g/L 时，菌株生长量无明显变化，而EPS 产量随着大豆蛋白胨质量浓度的增加而增加，当大豆蛋白胨的质量浓度为15 g/L 时，菌株RJ2-1-4 EPS 的合成量达到最大。随着质量浓度的继续增大，EPS 的合成量略有降低，可能是由于高质量浓度的大豆蛋白胨对菌体产生渗透胁迫，从而抑制EPS 的合成量。综上所述，乳酸片球菌RJ2-1-4 高产EPS 的最佳氮源质量浓度为15 g/L。

图9 不同大豆蛋白胨质量浓度对菌株RJ2-1-4 EPS 的影响Fig.9 Effect of different soybean peptone mass concentration on the EPS of RJ2-1-4

2.3.3 磷酸盐浓度对乳酸菌EPS 产量的影响 无机盐是微生物生长繁殖过程中必不可少的物质，对构成菌体细胞成分，调节发酵液的酸度，保持pH 值的稳定，促进菌株生长代谢有重要的作用。本试验以MRS 培养基中的磷酸氢二钾为基础磷酸盐，通过改变磷酸氢二钾的质量浓度，考察乳酸片球菌RJ2-1-4 高产EPS 的最佳磷酸盐质量浓度。试验结果见图10。

由图10可知，菌株RJ2-1-4 EPS 的合成量随着磷酸氢二钾质量浓度的升高呈现先增加后减小的趋势，在磷酸氢二钾质量浓度为6 g/L 和8 g/L 时，EPS 生成量明显高于对照组（2 g/L），当质量浓度大于8 g/L 时，EPS 的合成量减少，而菌体生长量随着磷酸氢二钾质量浓度的增大而缓慢增加，这与EPS 产量的变化无相关性。综上所述，在一定质量浓度范围内，菌株EPS 的合成量随着磷酸氢二钾质量浓度的增加呈现先增大后减少的趋势。

图10 不同磷酸氢二钾浓度对菌株RJ2-1-4 EPS 的影响Fig.10 Effects of different concentrations of dipotassium hydrogen phosphate on the EPS of RJ2-1-4

2.3.4 正交试验结果 以上述单因素研究结果为基础，以葡萄糖、大豆蛋白胨以及磷酸氢二钾质量浓度为参考因素进行3 因素3 水平的正交试验，以确定菌株RJ2-1-4 合成EPS 的最佳培养基成分。利用酶标仪测定OD595nm值，通过标曲计算EPS产量。正交试验因素及水平编码表见表3。正交试验结果见表6。

表6 乳酸菌RJ2-1-4 产EPS 最佳培养基成分正交试验结果Table 6 Orthogonal experimental results of optimal medium composition of EPS produced by LAB RJ2-1-4

由表6可知，菌株RJ2-1-4 EPS 产量最大的组合为A1B3C3（A 为葡萄糖，B 为大豆蛋白胨，C 为磷酸氢二钾），最大值为（427.83±18.40） mg/L，相比于未优化前EPS 产量（299.08±23.20）mg/L 提高了约30%。根据极差分析得出各因素对结果的主次顺序为：B>A>C。大豆蛋白胨的质量浓度对其影响最大，其次是葡萄糖，而磷酸盐的添加量对试验结果影响最小。根据均值分析得出最优组合为A1B3C3，综上所述，乳酸片球菌RJ2-1-4 产EPS 的最佳培养基组合为葡萄糖为20 g/L，大豆蛋白胨为20 g/L，磷酸氢二钾为8 g/L。

3 结论

1）对课题组前期分离出的41 株乳酸菌以高产生物膜为指标进行筛选，最终得到10 株生物膜产量较高的菌株。经16S rDNA 基因组序列分析得出，乳酸菌RM1-1-4、TG1-1-10、RJ2-1-4、TG1-1-11 为乳酸片球菌，RJ1-1-4 为植物乳杆菌，TG7-1-1 为乳酸乳球菌，TG7-1-6 为乳酸乳球菌乳脂亚种，RM3-1-4、RM2-1-5 为坚韧肠球菌，TG5-1-5 为肠膜明串珠菌。

2）通过单因素试验和正交试验，探究不同培养基成分对乳酸片球菌RJ2-1-4 EPS 产量的影响。最佳培养基组合为：葡萄糖为20 g/L，大豆蛋白胨为20 g/L，磷酸氢二钾为8 g/L。优化后EPS产量为 （427.83±18.40） mg/L，较优化前提高约30%，为后续胞外多糖的深入研究奠定基础。