德宏州油茶炭疽病拮抗内生芽孢杆菌6715的筛选与鉴定*

周嫒婷，王芳，尹加笔 ，刘丽，张东华，洪英娣，沈德周，马焕成，伍建榕,

(1.西南林业大学生物多样性保护学院，云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学林学院，国家林业和草原局西南地区生物多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224；3.德宏州林业和草原局，云南 德宏 678400)

油茶(Camelliaoleifera)属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)[1]，是一种经济树种，不仅能榨取高质量的食用油，而且具有一定的生态价值[2]。近年来由于炭疽病的流行，导致油茶严重落花、落果、甚至整株植株死亡[3]，造成油茶产量和产品质量急剧下降。对此，化学防治是主要防治措施，进而导致农药残留、病原菌产生抗性、污染环境等，而生物防治因绿色、安全、高效的特点逐渐成为了化学防治的有效替代措施。所以，本文针对油茶炭疽病开展生物防治研究。

芽孢杆菌(Bacillusspp.)是目前研究最广泛的生物防治剂，已被广泛用于开发生物农药和杀真菌剂，主要是由于其次级抗微生物代谢产物在植物病害中发挥重要保护作用，其中脂肽类物质就是其中之一[4]，该类物质因具有理想特性而备受关注，如广谱性、低毒性、抗微生物活性强等[5]。Zhu M等[6]发现菌株F85贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)和T113淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)对根肿病害具有显著的抑制作用。信珊珊等[7]从水稻(Oryzasativa)根部分离到一株解淀粉芽孢杆菌，进一步研究发现其发酵液中的脂肽类物质引起油茶炭疽病菌丝畸形而产生抑制作用。本研究拟对油茶健康叶片中分离的内生细菌进行鉴定，后通过平板对峙法筛选对油茶炭疽菌具有高效抑菌活性的拮抗细菌，并初步探讨高效拮抗细菌的抑菌机制，为油茶炭疽病的绿色防治及新型生物农药的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病原真菌

炭疽菌(Colletotrichumfructicola)于德宏州油茶基地感病叶片中分离得到，该菌株保存于西南林业大学生物多样性保护与利用学院病理学实验室。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基 1 L的培养基含200 g马铃薯，20 g葡萄糖，15～20 g琼脂，121 ℃灭菌30 min。

LB培养基 1 L的培养基含10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L Nacl，15～20 g琼脂，121 ℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 内生细菌的分离

从德宏州油茶基地采集健康叶片和果实，参考方中达[8]的方法，分离内生细菌。材料均用自来水冲洗1 min，以去除表面杂质，后放入75%乙醇溶液中浸泡消毒2～3 s，接着用无菌水清洗3遍，以除去残余的乙醇溶液，最后用无菌刀片切下健康组织5 mm×5 mm的小块，将其转移至LB固体培养基中，置于28 ℃培养箱培养48 h，用划线法纯化菌株[9]，4 ℃斜面保存。

1.2.2 内生细菌16S rRNA序列分析

参照生工细菌试剂盒说明书进行DNA提取，然后利用细菌通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)[10]扩增16S rRNA片段，扩增的PCR产物送硕擎生物技术有限公司测序，所得序列在Etaxon网站(网址https://www.ezbiocloud.net/identify)比对分析。

PCR反应体系(50 μL)：25 μL Mix，20 μL ddH2O，1 μL 27F，1 μL 1492R，3 μL DNA模板。PCR反应条件：95 ℃变性5 min，94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，33个循环；72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。

1.2.3 内生细菌的体外抑菌效果筛选

采用平板对峙法[11]筛选拮抗菌株。炭疽菌于PDA培养基培养7 d，制成直径6 mm的菌块，然后移至新的PDA培养皿中央。用待测菌株菌悬液(每片滤纸片打5 μL，OD600=0.1)点接至距离培养皿中央3 cm的4个位置处，无菌水处理作对照，每处理3次重复，置于26 ℃培养箱培养，第4 d起每天记录病原菌直径，计算抑菌率[10]，抑菌率公式如下所示。

抑菌率=[(未处理病原菌直径-处理病原菌直径)/未处理病原菌直径]×100%

1.2.4 抑菌效果最佳菌株在油茶离体叶片上对炭疽菌的抑制效果

经体外平板对峙培养法筛选25株内生细菌对炭疽菌的抑制效果后，选择抑菌率最高的1株内生细菌进行叶片回接。回接共设4个处理：(1)无菌水(对照)；(2)菌悬液；(3)炭疽菌；(4)菌悬液+炭疽菌，每处理3次重复。回接后叶片质量标准参照表1。

表1 油茶叶片质量分级标准

用无菌针刺伤叶片中央，菌悬液培养24 h后，均匀喷施于叶片表面，再过24 h后在刺伤位置接种直径5 mm的病原菌块，第4 d起每天观察记录，计算病情指数和发病率[12]，公式如下所示。

病情指数=[(各病级叶片数×该级代表数值)/(总叶片数×最高一级代表数值)]×100

发病率=(发病叶片总数/叶片总数)×100%

1.2.5 抑菌效果最佳菌株的鉴定

形态学鉴定 把单菌落转移至液体培养基，置摇床上28 ℃，180 r/min培养24 h。菌悬液摇匀后，取1 mL于1.5 mL离心管中，加入9 mL无菌水，用梯度稀释法制备1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8的稀释液。取100 μL 稀释液涂布于LB固体培养基中，置于28 ℃培养箱培养24 h，观察菌落形态特征[13]。

16S rRNA基因系统发育分析 抑菌效果最佳菌株扩增后的PCR产物送至硕擎生物技术有限公司测序，测得的序列在Etaxon网站中(网址https://www.ezbiocloud.net/identify)进行比对，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining构建系统发育树，确定该菌株的系统发育学地位。

1.2.6 抑菌效果最佳菌株脂肽基因检测

根据Farzand等[14]报道：Iturin、Bacillomycin、Fengycin、Bacillaene、Plipastatin、Bacillibactin、Surfacin和Bacylisin等脂肽类物质具有高效的抗真菌活性。本文以效果最佳菌株的DNA为模板，扩增该菌株相应脂肽基因，各脂肽基因特异性引物见表2。

表2 各脂肽基因引物信息

PCR反应体系(50 μL)：25 μL Mix，18 μL ddH2O，引物各2 μL，3 μL DNA模板。PCR反应条件：95 ℃变性3 min，94 ℃变性30 s，具体退火温度见表2，退火时间40 s，72 ℃延伸40 s，32个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.3 数据处理

数据处理及图表制作采用Excel 2010软件，数据显著性分析采用SPSS Statistics 17.0进行单因素ANOVA Duncan’s多重差异显著性分析，差异水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离与16S rRNA序列分析

本研究共获得25株内生细菌，均来自健康叶片，所得菌株经16S rRNA序列分析鉴定，结果见表3。

表3 25株内生细菌16S rRNA序列比对结果

表3显示：25株内生细菌其中88%的菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。其中菌株6701、6703、6705、6707、6708、6709、6712、6714、6715、6718、6719、6720和6725的近源菌为B.tequilensisKCTC 13622，其序列相似性在99.58%～99.93%之间，占总分离菌株数的52%。菌株6702与近源菌B.megateriumNBRC 15308的相似性为99.59%，占总分离菌株数的4%。菌株6704与B.mobilis0711P9-1相似性最高，其相似性为99.1%，占总分离菌株数的4%。菌株6706与B.velezensisCR-502相似性最高，其相似性为99.21%，占总分离菌株数的4%。菌株6710与B.proteolyticusTD42相似性最高，相似性为99.59%，占总分离菌株数的4%。菌株6711和6717与近源菌B.halotoleransATCC 25096相似性最高，序列相似性为99.3%，占总分离菌株数的8%。菌株6713与S.sciuriDSM 20345相似性最高，其相似性为99.86%，占总分离菌株数的4%。菌株6716与近源菌B.siamensisKCTC 13613相似性为99.37%，占总分离菌株数的4%。菌株6721与L.adecarboxylataNBRC 102595相似性最高，相似性为99.71%，占总分离菌株数的4%。菌株6722和6723与近源菌B.zanthoxyli1433相似性最高，序列相似性在99.58%～99.65%之间，占总分离菌株数的8%。菌株6724与P.intestiniLAH16相似性最高，相似性为99.23%，占总分离菌株数的4%。

2.2 25株内生细菌的体外抑菌效果筛选

以油茶炭疽菌为指示菌，分离得到的25株内生细菌为待测菌株，用平板对峙法测定各待测菌株的抑菌效果，结果见图1和图2。由图1可见，菌株6715的抑菌效果最好。

图1 25株内生细菌对油茶炭疽菌的体外抑菌作用注：开展对峙培养实验的第7 d效果。Fig.1 Antagonistic activity of 25 strains isolated from healthyC.oleifera leaf against Colletotrichum fructicola in vitro

图2 25株内生细菌对油茶炭疽菌的抑菌率注：第7 d 25株内生细菌对油茶炭疽菌的抑菌率结果；不同字母经单因素ANOVA Duncan’s多重差异显著性分析，差异水平为P<0.05。Fig.2 The inhibitory rate of 25 endophytic bacteriastrains against Colletotrichum fructicola

图2可见菌株6715抑菌率最高(57.59%)，显著高于其他待测菌株，占比为4%。菌株6703、6705、6706、6707、6708、6709、6711、6712、6714、6718、6719、6720和6725共13株内生细菌抑菌率在40%～50%之间，占25株菌株总数的52%，且不同菌株间抑菌率差异不显著。菌株6701和6717抑菌率在30%～40%之间，占比为8%。菌株6716抑菌率在20%～30%之间，占比为4%。菌株6704、6723和6724抑菌率在10%～20%之间，占比为12%。菌株6702和6713抑菌率在0～10%之间，占比为8%。菌株6710、6721和6722抑菌率在-10%～0%之间，占比为12%。

2.3 抑菌效果最好菌株6715在离体油茶叶片上对炭疽菌的抑制效果

经体外平板对峙培养法筛选出菌株6715对该病原真菌的抑制效果最佳，对其进行叶片回接，各处理回接第10 d的结果见图3、表4和图4。

图3 菌株6715在离体叶片上对油茶炭疽菌的抑制效果注：为叶片回接第10 d的效果，处理1、处理2、处理3、处理4分别表示无菌水(对照)(1-1，1-2，1-3)、菌悬液6715(2-1，2-2，2-3)、油茶炭疽菌(3-1，3-2，3-3)、菌悬液+油茶炭疽菌(4-1，4-2，4-3)。Fig.3 Inhibitory effects of strain 6715 againstColletotrichum fructicola on detached leaves ofC.oleifera after inoculation 10 days

表4 离体叶片病斑直径及发病率

图4 第10 d病斑直径注：叶片回接第10 d数据，不同字母经单因素ANOVA Duncan’s多重差异显著性分析，差异水平为P<0.05。Fig.4 Effects of strain 6715 on lesion diameterafter inoculation 10 days

图3和表4可以明显的看出，处理1(无菌水，对照)和处理2(菌悬液6715)在整个时段内回接的叶片均未发病，且叶片颜色均为亮绿色，说明内生菌株6715为非致病菌。回接第7 d时，处理3(油茶炭疽菌)，叶片均出现病斑，病斑较小，叶片颜色逐渐褪去，其发病率为100%，病情指数为25。同时，处理4(菌悬液6715+油茶炭疽菌)部分叶片出现病斑，不明显，较为轻微，叶片颜色基本未发生变化，其发病率为44.44%，病情指数为11，显著低于处理3(油茶炭疽菌)。回接第10 d时，处理3(油茶炭疽菌)，叶片病斑明显增大，病斑直径为5.36 mm，显著高于处理4(菌悬液6715+油茶炭疽菌)(图4)，叶片颜色由亮绿色褪为黄绿色，病情指数达50，增加为第7 d处理的2倍。同时，处理4(菌悬液6715+油茶炭疽菌)叶片均出现病斑，病斑较小，直径为1.84 mm，较为轻微，显著低于处理3，叶片颜色微微褪绿，变化不大，病情指数增大到25。以上结果表明，内生菌株6715为非致病菌，且对油茶炭疽菌有较好的抑制活性。

2.4 抑菌效果最好菌株6715的鉴定

2.4.1 形态学

菌株6715的液体培养单菌落，于摇床28 ℃、180 r/min过夜培养。取100 μL 1×10-6的稀释液涂布，恒温箱28 ℃培养24 h后进行革兰氏染色，结果见图5。

图5 菌株6715形态特征

菌株6715培养基上菌落呈乳白色，近圆形，菌体干燥、无粘性，表面粗糙，菌落中央有皱褶产生。革兰氏染色结果表明，该菌株为阳性菌，呈棒杆状。

2.4.2 16S rRNA基因系统发育聚类图

通过对菌株6715的16S rRNA基因发育系统(图6)的分析，发现与其相似性最高的菌株为SJ33(MG396987)，序列相似性为100%，且与B.tequilensis种的菌株聚为一支，所以，将菌株6715鉴定为B.tequilensis。

2.5 菌株6715脂肽基因检测

由图7可以看出，通过对菌株6715脂肽基因进行检测发现，该菌株存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)，但是脂肽基因fenD、baC、baE、bmyB、ituB均未检测到，其中检测到的基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分别与Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3种脂肽物质相对应。

图6 菌株6715 16S rRNA基因系统发育分析

图7 菌株6715脂肽基因扩增结果注：M表示Marker，1，2，3，4，5，6，7，8分别是基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)、srfAA(200 bp)、fenD、baC、baE、bmyB、ituB，其中基因4，5，6，7，8未检测到。Fig.7 Electrophoresis of biosynthesis genes for strain 6715

3 讨论与结论

3.1 讨论

本次研究从健康叶片共获得25株内生细菌，经分子鉴定表明：有88%的菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。其中13株与近源菌B.tequilensisKCTC 13622的序列相似性在99.58%～99.93%之间，占总分离菌株数的52%，推测B.tequilensis为当地油茶产区内生细菌的优势类群。有学者表明，从解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)中检测到存在促生长的植物激素IAA[15]，同时，本研究在平板对峙实验中发现，芽孢杆菌属的菌株，可能抑制或促进病原菌的生长。另外，菌株6715叶片回接抑菌效果显示与平板对峙结果有高度的相关性，而对于该菌株盆栽活体苗的回接效果有待进一步研究。

本研究发现菌株6715对油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率为57.59%，经16S rRNA序列分析鉴定为B.tequilensis。据报道B.tequilensis在研究中表现出较好的生防应用能力，Bhattacharya等[16]研究表明，B.tequilensis对番茄枯萎病菌镰刀菌有高效的拮抗活性。Hui Li[17]在水稻稻瘟病(PyriculariaoryzaeCav.)研究中发现，内生细菌B.tequilensis能够显著抑制稻瘟病病原菌的生长。Claudia Guerrero-Barajasa[18]报道了B.tequilensis能够减轻由胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起的牛油果炭疽病的发生，且其对炭疽病菌的抑制率为60%。对其生防机制进行初探，发现菌株6715存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分别与Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3种物质相对应，均属于脂肽家族。研究表明，脂肽类物质是一类由非核糖体途径合成的具有抗细菌和抗真菌作用属性的生物活性分子[19]，包含Surfacin、Iturin和Fengycin 3类。研究报道脂肽类物质主要是靠自身的两亲性和与目标物的互作，致使靶细胞膜结构发生改变，从而改变致病菌细胞膜的渗透性，进而控制致病菌的生长[20]。Surfacin是很强的表面活性剂，有研究发现，其与抗菌活性密切相关，能较好的抑制黄单胞杆菌(Xanthomonas)，当缺乏合成与Surfacin相关的防御基因时，抑制效果显著下降[21];脂肽类Bacylisin在黄瓜枯萎病[Fusariumoxysporum(Schl.) F.spcucumerinumOwen]和辣椒疫霉病(PhytophthoracapsiciLeonian)的生物防治中表现出良好的活性[22];脂肽类Plipastatin通过使镰刀菌(Fusariumgraminearum)菌丝发生空泡化、菌丝缠绕凝结阻碍菌丝正常分枝，导致菌丝畸形，从而对病原菌表现出良好的拮抗活性[23]。对于菌株6715代谢物是否能有效产生Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3种脂肽物质以及菌株6715对油茶炭疽菌的抑制作用机理，尚有待进一步研究。

3.2 结论

本次研究从健康叶片共获得25株内生细菌，经分子鉴定表明：有88%的菌株属于芽孢杆菌属，其中B.tequilensis的分离率最高，占总分离菌株数的52%，推测B.tequilensis为当地油茶产区内生细菌的优势类群。同时，发现菌株6715(B.tequilensis)对油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率为57.59%。对其生防机制进行初探，发现菌株6715存在脂肽基因bacA(500 bp)、ppsD(350 bp)和srfAA(200 bp)分别与Bacylisin、Plipastatin和Surfacin 3种物质相对应，均属于脂肽家族。