培元通脑胶囊重金属生物利用度研究及风险评估

李艳华，赵啸虎，张红梅

（1.吉林大学第一医院日间观察病房，吉林 长春 130021；2.吉林省药品检验所，吉林 长春 130033；3.吉林大学第一医院药学部，吉林 长春 130021）

中成药所含重金属成分的作用具有两重性，既可作为药物的有效成分，又会对人体有一定的毒性，如朱砂中的汞和雄黄中的砷等。例如在化风丹中5种常见金属元素中，日剂量的Pb元素少量超标，Hg元素和As元素超标较多[1]。由于化风丹处方中含有朱砂和雄黄，Hg元素和As元素分别为其主要成分，且实验中含量测定样品是经硝酸、双氧水消解制备而成，制备条件不同于人体消化环境，结果中得到的金属离子并不完全是人体吸收的部分，故不能认为人体吸收重金属含量超标。中药中的重金属含量与其在体内的吸收含量是不同的，所含的重金属是否会引起中毒取决于吸收的量，而不完全是其含量[2]。口服给药时，药物溶出后被人体吸收（生物可利用部分）才可能产生毒性，如果测定总浓度而不考虑生物利用度，会高估重金属对人体造成的健康风险[3]。

由于重金属具有不易降解性、食物链传递性和积累性，所以动物类药材重金属超标率较植物类药材更高[4]。培元通脑胶囊由制何首乌、熟地黄、天冬、龟甲（醋制）、鹿茸、全蝎、烫水蛭和地龙等中药精制而成，既包含了植物药也包含了动物药。植物药重金属污染与药材生长的环境条件有关，如大气、土壤、水、农药和化肥的施用等[5]。动物药重金属污染的原因，一方面是动物吃了受污染的植物药，药材含有有害重金属，在生物体内容易蓄积，半衰期长，不易分解，在体内慢慢富集，造成重金属超标；另一方面与动物药材的遗传特性有关，即对重金属元素的主动吸收和富集。动物药的生长环境易受重金属的污染，特别是水蛭和地龙，具有较强的重金属摄取和蓄积能力[6]。根据人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）颁布的Q3D对重金属元素杂质的潜在毒性进行评估，提取重金属元素杂质分类要求和残留限度规定了各金属元素的允许日暴露量[7]，其中1类重金属元素因具有明显毒性被评估为高风险元素，1类元素有砷（As）、铅（Pb）、汞（Hg）和铬（Cd）4种元素，因为中药材生长和炮制过程中很容易富集铜（Cu）元素，所以本研究将Cu元素加入检测。鉴于目前国内尚无对该药品重金属及有害物质检测的文献报道，本研究采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS），测定培元通脑胶囊中5种金属元素含量并计算生物利用度，对培元通脑胶囊进行风险评估，本研究的总重金属和可溶性重金属的含量比较研究对中成药的安全应用具有重要意义。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 7700 series ICP-MS（美国Agilent公司）；MARS 5微波消解仪（美国CEM公司）；XS105DU型分析天平（瑞士梅特勒公司）；Milli-Q纯水仪器（法国Millipore公司）；DSHZ-300A恒温振荡器（天津市天大天发科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

培元通脑胶囊（江南羚锐制药股份有限公司，批准文号：国药准字Z20000022，批号：1908112，1909061，1910301）规格为每粒装0.6g。Cu单元素标准溶液（08615-17123，1 000g L-1）、As单元素标准溶液（08611-18021，1 000g L-1）、Cd单元素标准溶液（08612-16011，1 000g L-1）、Hg单元素标准溶液（08617-17032，1 000g L-1）、Pb单元素标准溶液（08619-18031，1 000g L-1），以上元素标准溶液均购自国家标准物质研究中心；金（Ar）元素标准溶液（17725，1 000g mL-1）购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；内标溶液为铋（Bi）、锗（Ge）、铟（In）标准品储备液（23-170 VYY2，100 mg L-1）购自安捷伦公司，硝酸（优级纯，美国默克公司），胃蛋白酶（BCBZ7879，SIGMA），胰蛋白酶（SLBW1439，SIGMA）。

2 方法

2.1 ICP-MS工作条件

等离子功率：1 450 W；等离子气流速：15.0 L min-1；载气流速：0.9 L min-1；雾化气流速：0.85 L min-1；预混室温度：2℃。其中Hg和Pb的内标为Bi，Cd的内标为In，Cu和As的内标为Ge。

2.2 标准溶液制备

表1 实验用重金属标准溶液浓度Table 1 The standard solution concentration of heavy metals for the experiment

2.3 培元通脑胶囊中重金属含量待测液的预制备

精密称取培元通脑胶囊内容物0.5 g，置于消解管内，加硝酸5 mL，双氧水1 mL，混匀，置于微波消解仪内消解[1]。完成消解后，混合物冷却至室温，置于100 mL容量瓶中，将消解管用少量水洗涤3次并合并于容量瓶中，加入Ar元素标准溶液（1g mL-1）200L，用水稀释至刻度，充分摇匀，即得。

除不加Ar元素标准溶液外，同法制备试剂空白溶液。

2.4 体外消化实验

体外消化实验方法主要参考2020年版《中华人民共和国药典》第四部0921崩解时限检查法中附录来配制模拟胃、肠消化液[8]。

精密称取培元通脑胶囊内容物0.5 g，置于50 mL离心管中与20 mL模拟胃液混合并震荡1 min。混合物用恒温振荡器以250 r min-1在37℃振荡4 h，后以4 000 g min-1离心5 min，用0.45m滤膜过滤上清液15 mL，置于4℃冰箱中，后采用ICP-MS分析待测液中的金属含量，即为人工胃液中溶出含量。残渣与20 mL模拟肠液混合，采取与模拟胃液相同的方法震荡4 h，萃取，测定。

2.5 方法的线性关系、检出限

以在线内标法对系列标准溶液和空白溶液（2%硝酸溶液）进行检测。以元素的质量浓度（x，ng mL-1）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到各元素的线性回归方程及相关系数，并以空白溶液所产生的信号响应的标准偏差（）的3倍所对应的待测元素质量浓度作为仪器的检出限。

2.6 精密度试验

取标准曲线第3点溶液，连续进样6次，各元素含量RSD在0.90%~1.71%之间，表明仪器精密度较好。

2.7 稳定性试验

精密称取样品（批号：1910301）0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0、2、6、10、12、24 h时测定样品含量。

2.8 重复性试验

精密称取样品（批号：1910301）0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行试验6份。

2.9 加样回收率试验

精密称取培元通脑胶囊（批号：1910301）样品0.5g，加各测定元素相应的对照品溶液适量，按照“2.3”中的步骤制备供试品溶液，分别平行制备6份。

2.10 健康风险评估

本研究采用美国环保署（US EPA）发布的目标危害熵值法（THQ）[9]对人群进行潜在健康风险评估。如果THQ＞1，则暴露人群有健康风险；如果THQ≤1，则没有明显的健康风险。THQ值越高表明污染物对人体健康的危害越大。本文根据美国EPA的导则和相关数据确定了风险评估计算所涉及的参数以计算THQ。

式（1）中，C为培元通脑胶囊在体外模型中重金属质量分数（mg kg-1），EF（exposure frequency）表示平均每年暴露于含重金属培元通脑胶囊的频率（治疗周期为30~84 d[10,11]，取最大值约84 d/年），ED（exposure duration）表示平均暴露含重金属培元通脑的年数，FIR（food ingestion rate）表示含有重金属培元通脑胶囊的日摄入量，WAB（average body weight）表示平均体重，TA（average exposure time for non-carcinogens）为平均接触含重金属药物的时间，RFD（oral reference dose）代表非致癌污染物的安全剂量[9,12-14]。

当存在多个非致癌物质同时暴露时，不考虑相互作用，将每种污染物的非致癌风险相加，得到总危害商值（HI）。当HI＜1时，表示非致癌风险较小；当HI≥1时，表示非致癌风险较大。

3 结果与讨论

3.1 线性和检出限

表2结果表明，5种金属线性关系良好，符合分析要求。

表2 Cu、As、Cd、Hg和Pb 5种金属元素线性方程、线性范围和检出限Table 2 The linear equation,linear range and detection limit of five heavy metals including Cu,As,Cd,Hg and Pb

3.2 稳定性试验

Cu、As、Cd、Hg和Pb的RSD分别为0.95%、1.21%、1.33%、1.54%和1.85%，表明5种元素在24 h内稳定性良好。

3.3 重复性试验

Cu、As、Cd、Hg和Pb的RSD分别为0.95%、1.01%、1.07%、1.58%和1.66%，表明本方法重复性较好。

3.4 加样回收率试验

测定回收率在90.60%~101.17%之间，各元素的RSD在0.67%~3.88%之间，表明方法准确性较好，见表3。

表3 加样回收率试验结果Table 3 The result of the recovery test （n=6）

3.5 培元通脑胶囊中重金属总量及生物利用度

取3批次样品，测定样品中、胃液中和肠液中各金属的含量，每个样品平行测定3份，计算各金属总量及生物利用度，结果见表4。

表4 培元通脑胶囊中重金属总量及生物利用度Table 4 The total content and bioaccessibility of heavy metals in Peiyuan Tongnao Capsules

由表4可以看出，重金属生物可给量低于总重金属总量，说明重金属（Cu、As、Cd、Hg和Pb）在模拟人工胃肠液中不能完全被溶出吸收。重金属生物可给量均值由高到低依次为Hg（3.49 mg kg-1）＞As（3.11mg kg-1）＞Cu（1.82mg kg-1）＞Cd（0.32mg kg-1）＞Pb（0.26 mg kg-1），其中Cu的生物利用度为0.61~0.70，平均值为0.65；As元素为0.41~0.53，平均值为0.46；Cd元素为0.42~0.58，平均值为0.49；Hg为0.40~0.43，平均值为0.41；Pb元素为0.51~0.53，平均值为0.52。模拟人工胃液中各重金属的生物利用度大于其在模拟人工肠液中，表明重金属在胃液中较易溶出而在肠液中溶出较少。同一重金属在不同批次样品中生物利用度有一定的差异，可能和培元通脑胶囊中重金属的总量及存在的形态有关。

根据培元通脑胶囊（0.6 g 27粒）说明书，用法用量为每次3粒，每日3次，计算每日用量中含有Cu元素总量15.23g，生物可给量9.83g；As元素总量36.72g，生物可给量16.79g；Cd元素总量3.56g，生物可给量1.73g；Hg元素总量46.00g，生物可给量18.85g；Pb元素总量2.65g，生物可给量1.40g。参照FAO/WHO（JECFA）推荐的有害元素限量标准[15]，日剂量总量Hg元素超标，而生物可给量各元素均符合规定，说明培元通脑胶囊经过人工胃液和肠液模拟体内消化环境进行处理后，重金属生物可给量明显下降，远低于药物总重金属含量，5种重金属元素生物可给量均处于安全范围内，因此不能单纯以制剂中总重金属量作为评价中成药的毒性限度指标。

3.6 重金属风险评估

根据公式（1）计算THQ，求和值为HI，结果见表5。HI＜1，说明培元通脑胶囊中重金属对接触人群健康影响不明显。此外，HI生物可给量＜HI总量，表明用生物可给量评估重金属对人体危害小于以总重金属计。

表5 培元通脑胶囊的风险评估Table 5 The risk assessment of Peiyuan Tongnao Capsules

3.7 优势与不足

目前对中药重金属生物利用度研究较少，经过查阅文献，有学者做了野生青蒿[2]和柴胡饮片[12]的重金属生物利用度研究，但目前还没有中成药制剂生物利用度研究的报道。作者研究化风丹中5种常见金属的含量时发现，化风丹处方中含有朱砂和雄黄，Hg元素和As元素分别为其主要成分，故含量测定时日剂量Pb元素少量超标，Hg元素、As元素超标较多[1]。经过研究培元通脑胶囊的生物利用度测定结果，考虑化风丹中测得的Pb元素、Hg元素、As元素含量也未必是人体吸收含量。陈勇[16]研究发现化风丹治疗脑卒中疗效显著，不良反应少，考虑其中重金属元素含量在有效治疗范围，且不会引起毒性反应。李燕梅等[10]和孟宪举等[11]研究发现，培元通脑胶囊疗效显著，可明显改善患者症状，且不良反应少，考虑其吸收含量可达到有效治疗范围。

本实验方法存在一定的局限性，在后续的实验中我们会采用动物实验进行验证，以便对中药制剂中重金属含量和其潜在毒性之间的相关性进行准确评估。另外，本实验由于所选样品为心脑血管疾病所用药品，儿童用药几率较少，故未对儿童进行重金属风险评估。

4 结论

培元通脑胶囊在临床使用量较大，2020年版《中华人民共和国药典》（一部）未规定其限量标准，为提高安全性，有必要对其中重金属含量进行测定。本实验以ICP-MS法建立了一种迅速有效、专属性强的分析方法同时测定培元通脑胶囊中Cu、As、Cd、Hg和Pb的含量及这5种元素在人工胃液和肠液中的溶出情况，构建了体外消化模型，应用目标危害熵值法评估培元通脑胶囊中的重金属污染水平及人群的接触风险，结果表明，培元通脑胶囊中人体吸收重金属含量均处于安全范围内。本实验可为培元通脑胶囊质量控制提供依据，对其他中成药重金属生物利用度研究及风险评估提供参考。