基于脾气虚模型的四君子汤药理作用研究进展

阚鸿，曲帅

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；3.吉林省生物研究所，吉林 长春 130012）

脾胃学说是中医脾脏象理论的重要组成部分，传统中医理论认为脾为五脏六腑之一，是气血生化之源，后天之本，主司运化、主统血、主肌肉四肢。现代理论[1,2]认为脾的生理功能可能涉及到3个方面:（1）直接方面，主要是包括消化系统及能量代谢直接相关的一切器官系统；（2）间接方面，主要是指肌肉组织、血液系统和免疫功能；（3）调节方面，主要与神经及内分泌系统有关。在各种疾病因素作用下，脾运化功能失常时，可在临床上表现为脾气虚证，即面黄食少、泄泻或便秘、神疲乏力、少气懒言、舌淡苔白及脉虚弱等现象，在现代医学中则体现在胃肠道的消化吸收功能失调；神经、免疫、内分泌和运动等系统调节紊乱；营养物质代谢低下的虚损性疾病状态，表现为多系统和多器官功能衰弱的综合病理变化[3]。

近年来，脾气虚理论、脾气虚症候本质及治疗随着中医药的现代化发展得到进一步深入地研究。健脾益气是中医治疗脾气虚证的基本方法，临床上最经典的补脾益气方剂为四君子汤。四君子汤出自宋代《太平惠民合剂局方》，由人参、白术、茯苓和炙甘草4味药组成。方中人参大补脾胃之气；白术助君药人参燥湿健脾；茯苓健脾，渗湿利水；炙甘草和中益气，四药相辅，具有益气健脾之功效，临床上疗效显著。目前，四君子汤已经成为治疗脾气虚症的研究热点，其在器官水平、细胞水平和分子水平相关的药理药效研究也取得了一定的成果。因此本文从上述脾的3个方面生理功能，就近年来基于脾气虚证中四君子汤的药理作用相关研究进行综述，以期为四君子汤以及治疗脾气虚证的相关研究提供参考。

1 脾气虚证模型的建立

动物模型是表征中医症候模型、探究中医理论及中药药效的主要手段。脾气虚模型一般采用大鼠进行建模，其中以雄性Wistar大鼠，雄性SD大鼠最为常见，也有使用BALB/c雄性小鼠、昆明雌性小鼠、ICR小鼠、北京鸭和比格犬等动物进行造模[4,5]。造模方法主要有单因素造模法和复合造模法。单因素造模法即采用泻下方剂及利血平等药物或通过饮食、力竭法等单一方法刺激模型动物产生脾气虚证；而复合造模法多利用药物、饮食结合劳倦过度等方法联合制备脾气虚证，由于其症状更贴近于临床、重复性好，因此成为目前脾气虚证的主要造模方法。另外手术法和基因小鼠造模法也是研究脾气虚症的模型方法，但由于技术水平要求较高，目前没有得到广泛应用[6]。

造模成功的标准主要以《中药治疗脾虚证的临床研究指导原则》《中药新药临床研究指导原则》《大鼠脾虚证的内分泌研究》中脾气虚的宏观标准为指标进行判断，主要包括便形质软或溏稀；体重减轻、消瘦；食量减少；弓背，扎堆、蜷缩或眯眼；毛无光泽，肛温无明显变化；游泳耐力下降等多项指标。随着对脾气虚证的深入研究，一些微观指标例如木糖吸收率、免疫相关指标和血常规等指标也成为判断模型成功的补充证据[6]。

2 脾气虚证药理作用研究进展

2.1 四君子汤对脾气虚证消化系统及能量代谢方面的调节作用

中医理论中脾最根本的本质主要体现在物质代谢和机体能量转换。脾气虚证最典型的病症为胃肠功能失调紊乱，表现为消化吸收功能减弱等症状。四君子汤可从保护胃肠黏膜、调节消化系统的信号通路和维护胃肠道微生态等多方面对脾气虚证进行改善治疗。

脾气虚证大鼠胃肠黏膜上皮会出现坏死和脱落，上皮细胞内含有大量自噬泡、胃腺和肠腺萎缩及黏膜下层水肿等现象[7]，因此，细胞凋亡对黏膜上皮、腺体的损伤、再生和修复有很大的影响，在胃黏膜防御屏障的第5级防线中起重要作用[8]。研究表明，多胺对胃肠黏膜屏障功能具有重要的调控作用[9,10]，四君子汤可在分子水平上调精胺合酶mRNA，提高脾气虚证大鼠胃、肠黏膜多胺的含量，进一步提高胃黏膜紧密蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-3、粘附连接蛋白E-cadherin和-catenin的表达，降低大鼠胃黏膜caspase-3含量，抑制胃肠黏膜细胞凋亡，同时提高大鼠小肠黏膜三叶因子（TFF3）蛋白表达，促进受损胃肠黏膜的增殖与修复，增强胃肠黏膜的防御能力[11-15]。

在消化系统信号通路的研究上，陈玉龙等[16]发现四君子汤可恢复脾气虚大鼠唾液淀粉酶的分泌；进一步对脾气虚证大鼠腮腺中的VIP-cAMP信号通路研究发现，四君子汤可通过提高血管活性肠肽（VIP）含量，恢复cAMP和cAMP依赖蛋白激酶（protein kinase A，PKA）的活性，并提高PKA下游产物SNAP-23和VAMP-8蛋白表达，改善唾液淀粉酶的分泌障碍。四君子汤还可通过干预CNP-NPRB-cGMP信号通路，使大鼠血清中的C型钠尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）含量减少，降低位于胃窦平滑肌细胞膜上的B型钠尿肽受体（NPRB）的表达量，从而降低cGMP生成量，增强平滑肌自主收缩能力和大鼠胃排空能力；钙调素-肌球蛋白轻链激酶（CaM-MLCK）信号系统是胃肠道平滑肌细胞收缩舒张的核心步骤，在CaM-MLCK通路中，四君子汤可降低平滑肌组织CaM、MLCK表达量和Mg2+-ATPase活性，舒缓胃平滑肌的高张力，间接促进胃肠动力[17,18]。另外，段永强等[19]研究表明，四君子汤可通过降低脾气虚证大鼠血清、小肠中的P物质/胆囊收缩素（substance P/cholecystokinin，SP/CCK）含量，同时降低小肠MAPK14 mRNA相对表达量，调整MAPK信号通路，改善小肠蠕动速度，起到减少腹泻的作用。由于脾气虚证涉及多脏器、多系统，因此田茸等[20]将与机体多系统多脏器生理功能密切相关的钙调蛋白信号传导途径关键基因钙调蛋白/Ⅱ型钙调蛋白激酶（calmodulin/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaM/CaMKⅡ）的表达作为检测指标，从基因和蛋白水平对脾气虚证症候实质进行客观化研究，发现四君子汤具有抑制脾气虚证大鼠小肠组织中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达、促进脾气虚证大鼠脑组织中CaM/CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达的作用，揭示了四君子汤可通过CaM信号传导途径作用于脾气虚证中的脑肠微环境中，达到治疗的作用。

脾气虚证会引起肠道微生态失衡，菌群失调[21]。四君子汤可显著升高肠道双歧杆菌和乳酸杆菌菌量，调节肠道菌群的生长，使其产生挥发性脂肪酸，进而达到抑制致病菌和营养维持肠道黏膜防御屏障的功能[22]。除此之外，运用肠杆菌基因间重复一致序列-聚合酶链式反应（ERIC-PCR）技术、动态追踪分析及16SrDNA测序法和指纹图谱法等现代技术分析肠道菌群多样性变化后，发现四君子汤还可以通过提高肠道菌群的多样性，营养肠道黏膜，增强肠道黏膜防御能力[23,24]。

刘友章[25]在80年代提出了脾主肌肉与线粒体有密切的关系，并报道了脾气虚病人胃黏膜壁细胞线粒体数目减少、超微结构受损和能量代谢障碍，提出了中医脾-线粒体相关学说，为脾气虚的本质研究奠定了基础。研究证实[26,27]脾气虚证的病人及相关动物模型中动物胃黏膜中的主细胞和壁细胞、骨骼肌、心肌、十二指肠和肝细胞线粒体均可出现数目减少、肿胀、基质变浅、空泡变淡和嵴断裂等超微结构的改变，经四君子汤治疗后，脾气虚病症中的线粒体可以得到修复，形态和结构得到改善。

何丽娟等[28]采用酶联免疫吸附剂测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测大鼠胃组织cAMP及ATP活性，分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法（western blot）检测PKA、cAMP反应元件结合蛋白（cyclic-AMP response binding protein，cREB）、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP）、磷酸化酶激酶（phosphorylase kinase，PHK）mRNA和蛋白的表达，结果表明四君子汤均可增强脾气虚大鼠上述指标的表达，因此推测四君子汤治疗脾气虚证可能是通过激活胃cAMP-PKA信号转导通路，使cREB以及GP磷酸化，加速糖原酵解，从而产生能量。另外在肠道中，四君子汤通过调节小肠黏膜能量代谢功能相关酶琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）活性和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，改善脾气虚模型大鼠尿木糖排泄率，提高小肠黏膜ATP的含量，来修复脾气虚证中的能量代谢障碍[29,30]。

2.2 四君子汤对脾气虚证肌肉、血液及免疫方面的调节作用。

“脾气虚四肢不用”是脾气虚证的症候之一，表现出倦怠、乏力、纳呆等脾气虚症状。刘文俊等[31]认为“脾气虚四肢不用”可能与AMPK/ULK1途径激活的线粒体自噬水平提高不足有关，进一步通过对股四头肌线粒体自噬研究发现，四君子汤可减少线粒体过度自噬，降低线粒体的代谢副产物活性氧（reactive oxygen species,ROS）的累积，并显著降低股四头肌细胞凋亡水平[32]。对脾气虚模型大鼠的骨骼肌线粒体研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体-共激活因子-1（peroxisome proliferatoractivated receptor-coactivator-1,PGC-1）调控的信号通路异常，导致线粒体结构和功能的异常，呼吸链酶活性降低，线粒体氧化磷酸化下降，机体生物合成、能量代谢障碍，四君子汤可通过提高大鼠骨骼肌线粒体氧化磷酸化水平，修复骨骼肌线粒体损伤，同时升高大鼠骨骼肌线粒体超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和钠-钾ATP酶（Na+-K+-ATPase）活性，降低丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量，减轻线粒体氧化损伤，调节机体能量代谢[33,34]。通过采用激光共聚焦技术检测骨骼肌组织［Ca2+］i（细胞内Ca2+浓度）浓度发现，四君子汤可以升高［Ca2+］i浓度，同时提高脾气虚证大鼠骨骼肌组织能量代谢相关酶Na+-K+-ATPase和钙-镁ATP酶（Ca2+-Mg2+-ATPase）活性，恢复骨骼肌组织Ca2+/CaM-CaMKⅡ信号通路关键分子CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白正常表达[35]。

脾气虚的免疫学本质主要体现在红细胞C3b受体水平下降，T淋巴细胞亚群比例失衡，淋巴细胞分化能力下降甚至处于抑制状态，同时细胞因子表达异常，巨噬细胞功能受到抑制，免疫器官脾脏和胸腺的超微结构破坏[36]。

四君子汤能激活网状内皮系统的吞噬功能，提高外周血中T淋巴细胞百分率[37]，明显增加胃黏膜和外周血CD4+T细胞数量，降低CD8+T细胞的数量，使CD4+/CD8+比值升高，调节T淋巴细胞亚群的比例，增强胃黏膜免疫功能，防治慢性胃病的发生和发展[38,39]；同时增加胸腺指数和脾指数，提高机体免疫功能。针对脾气虚证细胞因子的表达异常，有研究表明四君子汤还可以调节小肠组织中的细胞因子IL-1、IL-6、IL-2、IL-4和IL-8水平，提高体液免疫中的免疫球蛋白IgG、IgM和IgA，通过平衡参和细胞与体液免疫的细胞因子免疫应答，发挥小肠黏膜免疫防御和抗炎的作用[5,16,38,40]。赵宁等[41]研究表明四君子汤可以调节脾气虚症大鼠空肠黏膜内的细胞因子TNF-和TNF-的含量，纠正空肠内细胞因子网络失衡，提高免疫抑制作用，增强机体的抵抗力和防御能力，使脾气虚证模型大鼠免疫能力趋向于正常大鼠。

2.3 四君子汤对脾气虚证神经、内分泌系统及其他方面的作用。

通常消化道系统黏膜损伤患者体内会出现5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）代谢异常，表现为血浆中5-HT、5-羟吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid,5-HIAA）增高，尿中5-HIAA排泄降低，四君子汤可抑制血浆中5-HIAA升高，调节胃肠运动，作用于摄食中枢促进进食[42]。冯晓帆等[43]采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）和ELISA的技术检测了大鼠下丘脑及海马中神经内分泌和免疫共同识别的信号物质P物质的含量以及mRNA的表达，结果显示四君子汤治疗组可显著升高大鼠下丘脑和海马中的P物质含量，提示四君子汤可通过调整脾气虚型大鼠脑区的P物质的量，起到调节神经内分泌免疫功能的作用[44]。

内分泌系统产生的胃肠激素与生物体的消化机能息息相关，可以促进胃肠运动，增加消化能力。例如神经肽-内啡肽（-EP）参与胃肠运动、胃和胰腺的分泌、摄食行为和糖代谢等活动，具有应激适应和减轻应激所致中枢及外周病理损害的作用[45,46]；内原性缩血管活性肽神经肽（neuropeptide Y,NPY）在体内可刺激食欲、增强营养物质吸收，是胃肠道体液和电解质分泌的强抑制剂[47,48]；降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）是广泛分布于胃肠部位的生物活性肽，可在胃黏膜受损时大量释放，提高局部血流量，修复黏膜，还可以同时减少胃酸分泌，减轻受损黏膜的刺激[49,50]。四君子汤一方面可促进生长抑素（somatostatin,SS）、胆囊收缩素（cholecystokinin,CCK）、胃动素（motilin,MTL）、胃泌素（gastrin,GAS）、VIP和醛固酮的分泌，加速胃排空[51-54]；另一方面，四君子汤通过调节血浆-EP的含量，参与机体全身应激的调节，应激时起到保护急性胃黏膜损伤的作用，同时提高脾气虚型大鼠血浆中的NPY含量，刺激食欲，改善CGRP的异常释放，缓解脾气虚证的胃肠功能和代谢紊乱[55]。

此外，四君子汤可通过改善胃黏膜血流量，升高血清SOD含量、降低血清MDA的含量[56]，恢复与增强体内抗氧化酶防御系统能力，增强机体清除自由基的能力，减轻脂质过氧化反应，实现对脾气虚型慢性萎缩性胃炎的治疗作用[57]。甄毕贤等[58]通过主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘运用代谢组学技术对脾气虚型大鼠进行分析，发现四君子汤可以通过调整脾气虚大鼠的脂类代谢、氨基酸代谢等多种代谢通路来完成其对脾气虚证的治疗作用。

3 总结与展望

脾气虚证的本质是四君子汤发挥治疗作用的理论基础，四君子汤治病机制的探讨也辅助认清脾气虚证的本质，二者相辅相成，相互促进。目前脾气虚证的模型建立成功与否多数依靠外观观察及行为学指标进行判断，还不能够完全模拟临床上的症状。随着脾气虚证的本质的不断深入研究，脾气虚证模型可通过更客观的检测性指标来进行判断和完善。目前，四君子汤的药理作用研究主要集中在对消化系统及能量代谢方面上，其他方面例如对免疫系统及神经系统的调节，治疗脾气虚证的相关通路和机制需要进一步挖掘和完善。中药复方虽然应用有上千年的历史，但是由于其化学成分复杂，作用于多器官、多靶点，组方药物之间具有高度协同性，因此需要不断深入挖掘其药效物质基础，明确其治疗疾病的机制与靶点，为推广传统方剂、开发利用中药新药及促进中医药的现代化发展奠定强有力的理论基础。