基于网络药理学和分子对接研究罗勒治疗排卵障碍性不孕症的作用机制

王潇，胡国静，隋新月，刘卉

（1.山东中医药大学，山东 济南 250014；2.山东中医药大学附属医院妇科，山东 济南 250014）

近年来，我国不孕症的发生率呈逐年上升趋势，已成为严重影响女性身心健康、家庭和谐的疾病之一。导致不孕症最为常见的原因是排卵障碍，约占所有原因的25%~50%[1]。排卵障碍性不孕症（Ovulatory Disorder Infertility,ODI）是指由于女性生殖系统受到一些因素的影响导致排卵障碍，不能够正常排卵，从而影响卵子与精子结合导致的不孕，常见的致病因素主要有下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO轴）功能异常、卵巢病变、一些全身性疾病和心理因素等[2]。目前临床治疗以药物为主，西医使用以克罗米芬（CC）为代表的药物进行促排卵治疗，此类药物可增加排卵率，但受孕率相对较低，且常产生流产、多胎妊娠和卵巢过度刺激综合征等问题[3,4]。因此找到一种促排卵效果好且副作用小的药物具有重要意义。

罗勒（Basil）是唇形目唇形科罗勒属植物，又名香菜、九层塔等，味辛、甘，性温，归胃、肺、脾、大肠经，为药食两用芳香植物，是一种常见易得的药材[5]。经临床观察，罗勒促排卵的效果显著[6]，但其分子机制尚未明确。网络药理学作为一门新学科，其整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的辨证论治和整体观念相吻合，能从生物学系统层面揭示药物与靶点的调控网络作用，是研究传统中药与现代药理学之间相互关系的桥梁[7-9]。研究旨在通过网络药理学探寻罗勒治疗排卵障碍性不孕症的有效成分及作用靶点，并分析其生物过程及信号通路，进而阐述其作用机制，为进一步的实验研究及临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 罗勒化学成分及靶点获取

基于中医药研究综合数据库（TCMID）及相关文献[10]获取罗勒的化学成分，将文献中成分在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中根据类药性（DL）≥0.18及口服生物利用度（OB）≥30%筛选，使用有机小分子生物活性数据库（PubChem）获得上述成分的SDF结构，导入生物活性小分子靶向预测平台（Swiss Target Prediction）获得药物靶点。

1.2 ODI疾病靶点获取

以“Ovulatory Disorder Infertility”为关键词，使用在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）及人类基因综合数据库（GeneCards）分别进行检索，去重后，获得ODI疾病相关靶点。

1.3 罗勒治疗ODI的网络构建

将药物靶点与疾病靶点利用Venny 2.1取交集，得到罗勒与ODI的共同靶点，并绘制韦恩图。通过Cytoscape 3.7.2软件构建“罗勒-有效成分-ODI-靶点”相互作用网络图，并使用软件中Network Analyzer功能进行分析，根据节点自由度（Degree）将有效成分排序。

1.4 构建蛋白质相互作用（PPI）网络

将韦恩图中得到的药物-疾病共同靶点输入蛋白互作平台（STRING）中进行网络构建，设置最低相互作用阈值为0.4，蛋白种类为“Homo sapiens”，获取罗勒治疗ODI靶点的互作关系，将得到的TSV格式文件导入Cytoscape 3.7.2软件进行再现美化与拓扑异构分析，选择Degree值≥25进行筛选，获得罗勒治疗ODI的核心靶点。

1.5 富集分析

将药物-疾病共同靶点上传至功能富集分析数据库（DAVID），物种及背景设置为“Homo sapiens”，进行靶点基因的基因本体论（GO）与京都基因和基因组百科全书（KEGG）功能富集分析，并将结果以图的形式呈现。

1.6 分子对接验证

使用PubChem数据库下载有效成分结构，使用AutodockTools 1.5.6对配体小分子加氢、加电荷、检测配体的root、进行可旋转键的搜寻与定义并保存为pdbqt文件。RCSB Protein Data Bank数据库下载核心靶点蛋白的三维结构，使用AutodockTools1.5.6软件添加氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢后将其定义为受体并保存成pdbqt文件。确定Vina分子对接的坐标和盒子大小，最后运用Autodock vina 1.1.2对有效成分与核心靶点蛋白进行半柔性对接。

2 结果

2.1 成分及靶点筛选

通过TCMID数据库共检索得到罗勒含有的15个化合物，分别是(+)-car-3-ene-2,5-dione、2-呋喃羧酸（2-Furancarboxylic Acid）、茴香脑（Anethole）、双环水芹烯（Bicyclosesquiphellandrene）、carene-3、D-n-甲基椰油碱（D-n-methyl coclaurine）、桉树脑（Eucalyptol）、桉树蜡（Eucalyptus wax）、丁子香酚（Eugenol）、丁子香酮（Eugenone）、异栎素（Isoquercitrin）、肉桂酸甲酯（Methylcinnamate）、对甲氧基肉桂酸（P-Methoxycinnamic Acid）、对甲氧基肉桂醛（P-methoxycinnamaldehyde）和黄樟素（Safrole）；文献中获得罗勒化合物37个，其中符合TCMSP数据库的化合物2个，分别为槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Keampferol）。通过Swiss Target Prediction数据库筛选出374个药物靶点。

2.2 潜在作用靶点预测

将ODI分别在OMIM、GeneCards数据库进行检索，筛选去重后获得疾病靶点977个。将药物靶点与疾病靶点输入Venny 2.1，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点53个，分别为PGR、AR、SERPINA6、SHBG、CYP17A1、CYP19A1、PTGES、ESR1、ESR2、MCL1、FAAH、HSD11B2、PTGS1、NOS2、AHR、F3、PTGS2、PPARA、SLC6A4、DRD2、DRD4、ADRB2、DRD5、OPRM1、TBXA2R、HTR2A、JUN、VEGFA、SRD5A1、KDR、TTR、MPI、PTPN22、MAPK10、MPO、CCND1、PDE3A、CYP11B1、MMP2、MMP14、CDK4、NOX4、TNF、IL2、MMP9、MMP1、NR4A1、HSD11B1、CASP3、HTT、NOS1、ALB和SLC16A7，见图1。

2.3 “罗勒-有效成分-ODI-靶点”相互作用的网络构建与分析

将整理好的罗勒化学成分与药物-疾病共同靶点数据上传至Cytoscape3.7.2软件，构建“罗勒-有效成分-ODI-靶点”可视化网络图，见图2。图中蓝色三角形代表罗勒中的15种有效成分（2种化学成分靶点与疾病靶点无交集，予删除），绿色六边形代表53个共同靶点。Degree值表示预测出该成分与作用靶点的关联个数，Degree值越大说明该成分越重要，以Degree值从大到小排名依次是(+)-car-3-ene-2,5-dione、D-n-甲基椰油碱（D-n-methyl coclaurine）、丁子香酮（Eugenone）、丁子香酚（Eugenol）、对甲氧基肉桂酸（P-Methoxycinnamic Acid）、carene-3、肉桂酸甲酯（Methylcinnamate）、槲皮素（Quercetin）、双环水芹烯（Bicyclosesquiphellandrene）、异栎素（Isoquercitrin）、茴香脑（Anethole）、黄樟素（Safrole）、对甲氧基肉桂醛（Pmethoxycinnamaldehyde）、桉树蜡（Eucalyptus wax）和桉树脑（Eucalyptol）。

2.4 PPI网络构建

将疾病-药物共同靶点上传至STRING数据库，获取TSV格式文件导入Cytoscape3.7.2软件绘制关键靶蛋白PPI网络图，见图3。圆圈越大、颜色越深代表关联度越大，在此网络中，度值大于25的靶点为ALB（Degree=36）、TNF（Degree=32）、VEGFA（Degree=30）、PTGS2（Degree=30）和JUN（Degree=27）。

图3 PPI网络图Fig.3 The PPI network analysis

2.5 富集分析

GO富集结果显示，交集基因共富集至158条生物学过程（Biological Process,BP）中，主要包括对缺氧的反应、对药物的反应、ERK1和ERK2级联的正调控、氧化还原过程、血压负调节、糖皮质激素生物合成过程、对脂多糖的反应、乳腺肺泡发育、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、内皮细胞增殖的正调控等；23条细胞组分表达过程（Cellular Component,CC）中，主要包括膜筏、内质网膜和质膜的组成部分等；46条与分子功能相关的过程（Molecular Function,MF）中，主要包括类固醇结合、血红素结合、RNA聚合酶II转录因子活性和配体激活的序列特异性DNA结合等。根据P值，将显著性排名靠前的条目进行可视化，见图4。KEGG通路分析主要涉及39条通路，根据P值，将显著性排名前20的条目进行可视化，见图5。KEGG显示，罗勒治疗ODI的作用机制主要涉及激素调节、炎症反应等，相关通路包括TNF信号通路、雌激素信号通路、卵巢类固醇生成、GnRH信号通路和PI3K-Akt信号通路等，这提示罗勒通过多通路来治疗ODI。

图4 GO富集分析图Fig.4 The GO enrichment analysis

图5 KEGG富集分析前20条通路Fig.5 The first 20 pathways of KEGG enrichment analysis

2.6 分子对接验证结果

通过将PPI网络图中度值前5的靶点ALB、TNF、VEGFA、PTGS2和JUN与15个有效成分进行分子对接，整理得到分子对接打分结果，见表1。结合自由能可以评估受体和配体之间的亲和性，一般认为结合能小于0时，配体和受体可以自由结合，且结合自由能越低，二者亲和力越强。结果显示，罗勒有效成分均与网络关键靶点具有较好结合活性，验证了本研究数据的可靠性，运用PyMOL软件对靶点基因结合活性最强有效成分对接结果进行可视化，见图6。

图6 槲皮素与PTGS2的分子对接构象图Fig.6 The molecular docking conformation diagram of quercetin and PTGS2

表1 有效成分与关键靶点分子对接结合自由能表Table 1 Table of molecules docking and binding free energy between the effective components and core targets

3 讨论

中医药治疗不孕症历史悠久，早在《素问·骨空论》中就提出“督脉者……此生病……其女子不孕”。不孕症是指未避孕、有正常性生活、夫妇同居一年而未受孕者。未避孕而从未妊娠者称为原发性不孕症，古称全不产；曾有过妊娠而后未避孕连续一年未妊娠者称为继发性不孕症，古称断续[11]。祖国医学在治疗不孕症方面有着疗效好、副作用小的优势。目前我国临床以中药复方促排卵居多，对于单味中药促排卵的研究较少。金维新等[12]使用罗勒胶囊（治疗组）治疗女性排卵功能障碍性不孕症，妊娠率高于克罗米芬组（对照组），且流产率更低。本文旨在通过网络药理学进一步揭示罗勒在分子层面的促排卵作用，为临床应用及新药开发提供研究基础。

罗勒治疗排卵障碍性不孕症的最主要有效化合物为槲皮素、异栎素和茴香脑。槲皮素为具有多种生物活性的黄酮醇类化合物，影响卵泡发育及排卵过程，通过降低HPO轴中ER、ER和PR的表达，进而调节血清中卵泡刺激素和黄体生成素分泌水平[13]。异栎素是一种常见的食用植物雌激素，已知能抑制缺氧诱导因子-1，在人体内与雌二醇的作用相当[14]。茴香脑可调节卵母细胞和胚胎中氧化还原平衡和改善线粒体功能，促进卵母细胞发育，从而促进排卵[15]。

罗勒主要通过TNF（肿瘤坏死因子）、PTGS2（前列腺素内过氧化物合酶2）、PGR（孕酮受体）、VEGFA（血管内皮生长因子A）、ESR1（雌激素受体1）和CYP19A1（细胞色素P450 19A1）等靶点作用于排卵障碍性不孕症。除抗肿瘤外，TNF还可以诱导颗粒细胞和早期卵泡凋亡，破坏血管内皮，影响卵巢供血、激素分泌和卵泡发育[16]。促性腺激素激增触发排卵，促性腺激素激增可诱导排卵前卵泡颗粒细胞中两个关键基因的表达，即PGR和PTGS2，它们分别激活两个独立的通路，这两个通路对成功排卵都是必不可少的，并且PGR发挥了一个额外的重要作用，可通过减少促性腺激素激增诱导的PTGS2表达来减轻排卵性炎症[17]。卵泡发育依赖于卵巢血管的生成，VEGFA是重要的调控血管内皮生长的因子，由其介导的血管生成对于卵巢卵泡的周期性生长和发育具有重要影响[18,19]。ESR1被认为是卵泡发育和成熟过程中的一个关键基因，ESR1能够编码一种雌激素受体，通过结合雌激素配体发挥生物学效应[20]。CYP19A1是芳香化酶P450（P450arom）的编码基因，P450arom在卵泡募集的过程中起着关键作用，可使雄烯二酮转化为雌二醇，并且刺激自身受体及黄体生成素受体的合成，也是卵巢内部局部调节机制中的重要因素之一[21]。由此可知罗勒主要通过调节与排卵相关的激素和减轻排卵性炎症，起到促排卵作用。

根据GO富集分析提示罗勒治疗排卵障碍性不孕症主要涉及对缺氧的反应、氧化还原过程、对药物的反应、内皮细胞增殖的正调控、对脂多糖的反应等生物过程。KEGG富集通路分析显示，关键靶点主要富集在激素调节、炎症反应等通路，包括TNF、雌激素、卵巢类固醇生成、GnRH和PI3K-Akt信号通路等。雌激素信号通路发挥其作用通过激活细胞质中的激酶，或者雌激素与雌激素受体结合后调节细胞核中的基因转录[22]，罗勒可通过调控雌激素信号通路调节雌激素的分泌来影响排卵的发生发展过程。促性腺激素释放激素（GnRH）是生殖过程中最重要的激素之一，由下丘脑合成并以脉冲方式释放，诱导促性腺激素—促黄体素和卵泡刺激素的合成和分泌。PI3K-AKT信号通路与卵巢颗粒细胞凋亡有关，多囊卵巢综合征（PCOS）是排卵障碍不孕症的主要类型之一，多囊患者子宫内膜常存在P13K-Akt信号通路的过度活化[23,24]。

综上所述，罗勒治疗排卵障碍不孕症是通过多成分多靶点多通路发挥作用的，通过调节关键靶点TNF、PTGS2、PGR、VEGFA、ESR1和CYP19A1的表达以及多种生物过程，最终作用于炎症反应及激素调节等相关通路，从而达到对排卵障碍性不孕症的治疗目的。本研究因数据有限，有一定局限性，但仍希望为排卵障碍性不孕症的治疗提供新思路。