复方苦芩结合针灸治疗犬细小病毒病及对犬肠黏膜的修复作用

李珍珍，关 璐，朱兆荣,2*，刘 娟,2，3*

(1.西南大学 动物医学院，重庆 荣昌 402460；2.重庆市高校兽医科学工程研究中心中兽药创新实验室，重庆 荣昌 402460；3.西南大学 医学研究院，重庆 荣昌 402460)

犬细小病毒病(canine parvovirus disease)是由犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)引起的急性传染病(犬第二大传染病)，能够导致幼犬剧烈呕吐、出血性肠炎、血性水样粪便、脱水、白细胞显著减少和心肌炎等症状[1-2]。目前，该病无有效的治疗方法，临床上主要采用对症治疗配合高免血清和单克隆抗体治疗为主。当犬细小病毒侵入机体时，机体发生炎症反应，犬血清中促炎因子TNF-α、IL-1、IL-2水平增加；肠黏膜产生大量炎症因子、炎症介质如IL-4、IL-5、IFN-γ等，损伤肠上皮细胞，诱导上皮细胞调亡，与凋亡细胞相邻的上皮细胞不能有效地封闭细胞所留下的空间，导致肠黏膜通透性增高。该病中兽医学辨证为湿热泄泻，由疫疠之气侵害机体，入侵脾胃，导致脾清阳不升而泻，胃浊阴不降而吐。治宜清热解毒，健脾燥湿、凉血止血[3]。

复方苦芩是根据中兽医理论和临床辨证论治的原则，选用苦参、黄芩、白头翁、黄芪、金银花等组成的中药复方，前期试验表明，复方苦芩具有清热利湿、止痢的作用[4]。中医针灸可调节脏腑机能，对胃肠道的损伤有着修复和治疗作用，研究表明，针灸可以通过改善小肠免疫达到提高全身免疫的功效。脾俞穴和天枢分别归属太阳膀胱经和足阳明胃肠经，是治疗胃肠疾病的重要穴位，小肠俞具有外散小肠腑之热的功效，交巢穴可以有效治疗脾虚泄泻，对脾胃有一定的疗效[5-6]。本试验旨在应用复方苦芩结合针灸脾俞、小肠俞、天枢、交巢穴等4个穴位治疗犬细小病毒病；通过观察病犬肠黏膜的病理变化，对比不同治疗方案，测定犬血清以及肠黏膜中的炎性因子，探究其对肠黏膜的修复作用，以探讨复方苦芩结合针灸治疗犬细小病毒病的疗效。

1 材料与方法

1.1 毒株与细胞犬细小病毒CPV-2，四川农业大学彭广能惠赠，由西南大学荣昌校区P2生物安全实验室保存；猫肾细胞(F81)，中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库提供(编号KCB-2006104YJ)。

1.2 实验动物40～60日龄中华田园犬180只，雌雄各半，体质量(1±0.5)kg，由西南大学荣昌校区实验动物中心提供，均接种过狂犬疫苗，左旋咪唑驱虫，隔离观察1周，确认健康无病且营养状态良好后用于试验。

1.3 主要药品及试剂黄芩、苦参、金银花、白头翁、广藿香等购自重庆荣昌县石家大药房；黄芪多糖注射液(批号：20150318)购自重庆天龙牧业科技有限公司；犬IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α和IFN-γ试剂盒(批号：201512)，均购自上海瑶韵生物制品有限公司。

1.4 主要仪器Nicolet iS50型红外光谱仪，赛默飞世尔科技有限公司；SE-2000型Nikon倒置显微镜，日本Nikon公司；3111型隔水式二氧化碳培养箱，Thermo Electron Corporation USA；SW-CJ-2F型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司)DC-NSG-10型多功能提取浓缩机组，上海达程实验设备有限公司；Bio-Rad Model 680 Microplate Reader，美国Bio-Rad Laboratories，Inc。

1.5 复方苦芩注射液制备与鉴定复方苦芩注射液制备方法：取黄芩167 g、苦参50 g、金银花167 g、白头翁133 g、广藿香117 g备用。将广藿香加10倍量的水浸泡4 h，加热回流提取4 h，收集藿香挥发油；将广藿香药渣与其余生药加水合煎3次，每次30 min，合并滤液，浓缩至生药1.0 g/mL；加乙醇使含醇量为60%，静置过夜，过滤，上清液回收乙醇至无醇味。浓缩至生药0.5 g/mL，加蒸馏水至生药1.0 g/mL，冷藏，过滤，滤液浓缩至生药0.25 g/mL；加乙醇使醇量达85%，冷藏，过滤，滤液回收乙醇至无醇味。加注射用水至生药1.0 g/mL，加藿香挥发油，按注射液要求调整为等渗药液，pH 7.0。用近红外光谱测定复方苦芩中的主要有效活性成分：将200 mg溴化钾经过烘干脱水置于玛瑙研钵中研磨5 min，进行充分研磨至200目左右，将研磨好的粉末转入磨具内，在15～20 MPa的压力下压片1 min，得到透明锭片；用毛笔将复方苦芩注射液均匀涂刷在薄片上，晾干，在反面同样涂刷，放置待晾干；同法制得溴化钾空片作为参比。在程序内设定测量背景，将样品放置在仪器内，开始测量，谱图处理。

1.6 犬细小病毒液制备用CPV感染正常猫肾细胞(F81)，置于5%CO2培养箱37℃吸附90 min，PBS清洗细胞，加维持液继续培养，每天观察细胞病变(CPE)，当80%以上细胞发生CPE时(几乎全部脱落)，连同细胞和培养液置-80℃反复冻融3次以裂解细胞，离心收集上清液，分装至2 mL 冻存管，-20℃保存，备用于模型建立。

1.7 动物分组及处理

1.7.1动物分组 将犬随机分为空白组、模型组、阳性药物组、复方苦芩组、针灸组、复方苦芩结合针灸组，每组30只。空白组犬灌服生理盐水5 mL/kg，其余各组犬灌服犬细小病毒液5 mL/kg(5×105PFU/mL)建立犬细小病毒病模型；参照文献[7]，犬若表现精神萎靡，采食量下降且不喜动，随后出现呕吐腹泻等症状，粪便呈番茄色水样稀便，并伴有腥臭味，用CPV试纸检测呈阳性，说明犬细小病毒病模型成功。造模成功后，模型组与空白组注射生理盐水1.5 mL/kg，2次/d(8:00,14:00各1次)，连续治疗5 d；复方苦芩组犬肌肉注射复方苦芩注射液1.5 mL/kg，2次/d(8:00,14:00各1次)，连续治疗5 d；复方苦芩结合针灸组犬肌肉注射复方苦芩注射液1.5 mL/kg，2次/d(8:00,14:00各1次)，连续治疗5 d，并在选定穴位上施针，每次留针20 min；针灸组在选定穴位上施针，每次留针20 min，2次/d；阳性药物组肌肉注射黄芪多糖注射液1.5 mL/kg，2次/d(8:00,14:00各1次)，连续治疗5 d。收集治疗效果，采取血清备存待测，每组随机选取5只麻醉后处死，采小肠肠段保存并制作病理切片。

1.7.2针灸治疗穴位的选取 选取脾俞、小肠俞、天枢、交巢等4个穴位作为治疗穴位。脾俞穴位于犬倒数第二肋间，背最长肌与髂肋肌之间的肌沟中，左右各1穴；小肠俞穴位于犬第六腰椎横突末端相对的髂肋肌沟中，左右侧各1穴；天枢穴位于犬脐眼旁开3 cm，左、右各1穴；交巢穴位于犬尾根与肛门间凹陷中，1穴。

1.7.3疗效标准制定 参考犬细小病毒病诊疗效果[8]制定。用药72～96 h后体温、精神、食欲恢复正常，小便正常，血便停止、粪便成形等视为痊愈；用药48 h后体温、精神、食欲均基本恢复正常，呕吐、腹泻临床症状明显减轻视为有效；用药96 h后临床症状无改善或恶化、死亡视为无效。

1.8 临床指标观察观察每组犬体温变化，记录退烧时间；观察每组犬排便情况，记录腹泻便血天数；观察每组犬食欲变化，记录呕吐消失时间，分析治疗效果。

1.9 犬血清中炎性因子含量的测定分别于1，2，4，5 d无菌采集犬后肢静脉凝血血样，4℃冰箱过夜，4 000 r/min离心10 min，吸取血清，严格按照酶联免疫(ELISA)试剂盒说明测定犬血清中IL-1、IL-2、TNF-α水平。

1.10 检测十二指肠组织结构试验5 d时，各试验组随机挑选5只犬，各组犬分别取距幽门2 cm处十二指肠5～6 cm，常规方法制作石蜡切片，进行苏木伊红(HE)染色，用光学显微镜进行镜检。

1.11 犬肠黏膜中炎性因子含量的测定在试验5 d 时，各试验组随机挑选5只犬，分别取2 g小肠组织，加入其5倍量的PBS(pH 7.4)，将标本充分匀浆。2 000 r/min离心20 min左右，收集上清液，严格按照酶联免疫(ELISA)试剂盒说明测定IL-4、IL-5、IFN-γ水平。

2 结果

2.1 复方苦芩注射液红外光谱鉴定结果图1为复方苦芩注射液红外图谱，3 002处为亚甲基反对称伸缩振动吸收峰；2 322,2 007和1 845处为三键和累积双键伸缩振动吸收峰；1 553处为苯环骨架振动吸收峰，是黄酮类成分吸收峰；1 276和1 209为醚键伸缩振动吸收峰，为生物碱类吸收峰；1 149和1 060 处为多糖类羟基振动吸收峰；且956,881,814,739,679处也均为多糖类羟基振动吸收峰。结果提示,该注射液含有黄酮类、生物碱类、多糖类物质。

图1 复方苦芩注射液红外图谱

2.2 临床治愈情况空白组犬精神状态佳，饮食欲良好，粪便正常，被毛整洁。模型组犬初期精神萎靡、采食量逐渐减少甚至废绝、随后出现呕吐、腹泻等症状，中期排番茄色水样稀便，并伴有腥臭味，后期便血且恶臭味加重。采用不同方案治疗后，可看出复方苦芩组的病犬退热时间和呕吐消失时间最快，复方苦芩结合针灸组犬腹泻症状消失最快(表1)。同时,治疗5 d后对比各组犬，复方苦芩结合针灸组犬治愈率最高达80%，复方苦芩结合针灸组犬症状明显减轻，体温、精神、食欲均恢复正常；阳性药物组、复方苦芩组犬和针灸组犬治愈率分别为73%,67 %和37 %(表2)。

表1 各组临床指标观察结果 d

表2 各组临床治愈结果

2.3 对CPV病犬十二指肠组织病理学观察结果由图2可看出，空白组肠绒毛结构完整，排列整齐，绒毛表面覆盖的单层柱状上皮细胞完整，中央乳糜管清晰可见。模型组十二指肠绒毛脱落，且萎缩坏死，长度变短，绒毛界限不分明，中央乳糜管消失。阳性药物组无绒毛脱落，绒毛轻度萎缩，界限清晰，上皮细胞轻度变性、坏死。复方苦芩组少许绒毛脱落，绒毛轻度萎缩，界限较清晰，上皮细胞轻度变性。针灸组绒毛脱落较多，绒毛中度萎缩，界限较其他治疗组模糊，上皮细胞轻度变性。复方苦芩结合针灸组少许绒毛脱落，绒毛轻度萎缩，界限清晰，细胞结构较为完整，固有形态清晰。各治疗组相对模型组均有好转趋势。

A.空白组;B.模型组;C.阳性药物组;D.复方苦芩组;E.针灸组;F;复方苦芩结合针灸组

2.4 对犬血清中IL-1、IL-2、TNF-α的影响由图3,4,5可知，与空白组比，试验1,2,4,5 d时模型组犬血清中IL-1、IL-2、TNF-α含量差异均极显著升高(P<0.01)。与模型组比，在试验1 d时复方苦芩组和针灸组IL-1含量差异显著降低(P<0.05)，试验2,4,5 d时复方苦芩组、针灸组、复方苦芩结合针灸组和阳性药物组IL-1含量差异均极显著降低(P<0.01)；试验1,2,4,5 d时复方苦芩组、针灸组、复方苦芩结合针灸组和阳性药物组IL-2含量差异均显著降低(P<0.05)；试验1,2,4,5 d时复方苦芩组、针灸组、复方苦芩结合针灸组TNF-α含量差异均极显著降低(P<0.01)。与阳性药物组比,试验5 d 时复方苦芩结合针灸组IL-1、TNF-α含量差异极显著降低(P<0.01)，IL-2含量差异显著降低(P<0.05)。

A.1 d;B.2 d;C.4 d;D.5 d。与空白组比较,**示P<0.01；与模型组比较，Δ示P<0.05，ΔΔ示P<0.01；与阳性药物组比较，#示P<0.05，## P<0.01。下同

图4 各组犬血清中IL-2的影响

图5 各组犬血清中TNF-α的影响

2.5 对犬肠黏膜中IL-4、IL-5、IFN-γ的影响从图6，7，8可知，与空白组比，试验1，2，4，5 d时，模型组犬肠黏膜中IL-4、IL-5、IFN-γ含量差异极显著升高(P<0.01)。与模型组比，试验1，2，4，5 d时复方苦芩组、针灸组和复方苦芩结合针灸组犬肠黏膜中IL-4含量均差异极显著降低(P<0.01)；试验1，2，4，5 d 时复方苦芩结合针灸组与试验2，4，5 d时针灸组犬肠黏膜中IL-5含量均差异极显著降低(P<0.01)；复方苦芩组、针灸组试验1 d时IFN-γ含量均差异显著降低(P<0.05)，复方苦芩组、针灸组在试验2，4，5 d时IFN-γ含量均差异极显著降低(P<0.01)；与阳性药物组比，于试验5 d时复方苦芩结合针灸组IL-4、IL-5、IFN-γ含量差异极显著降低(P<0.01)。

图6 各组对犬肠黏膜中IL-4的影响

图7 各组对犬肠黏膜中IL-5的影响

3 讨论

复方苦芩由黄芩、苦参、白头翁、栀子、金银花等中药组成，通过傅里叶红外光谱对复方苦芩注射液进行检测，测得总多糖、总黄酮、总生物碱等3种主要有效成分，通过前期试验结果表明，此3种成分对犬细小病毒病犬小肠组织均有一定的保护作用[9]。据报道，复方苦芩具有清热解毒、凉血止痢、健脾利湿之功效，对犬细小病毒病具有良好的防治效果[10-12]。针灸具有疏通经络、调和阴阳、扶正祛邪之功。本试验结果表明，复方苦芩结合针灸治疗能持久有效地缓解病犬临床症状，且对比单独使用复方苦芩、针灸治疗，复方苦芩结合针灸治疗腹泻症状消失快，治愈率最高，达80%，具有明显减弱肠道炎症反应的作用，从而达到治疗犬细小病毒病的功效。

犬细小病毒病肠炎型肠道损坏严重，导致小肠黏膜脱落。小肠黏膜上的小肠绒毛有过滤物质及增强对物质的吸收等作用，其中由小肠绒毛、肠黏膜基底膜及其表面的黏液层等组成的肠黏膜屏障是肠道防御机制最重要的环节，当肠黏膜屏障受到破坏时，肠道内大量细菌和毒素将通过小肠进入机体内，从而引发各种炎性疾病[13]。相关研究结果表明，中草药能有效保护小肠肠黏膜屏障，降低其通透性，增强肠黏膜屏障的功能[14]。电针天枢、交巢等穴位对结肠局部的脑肠肽紊乱有调节作用，同时能够增强肠黏膜屏障免疫功能，有效防止腹泻的发生[15-16]。本试验结果表明，复方苦芩结合针灸治疗对病犬小肠绒毛膜具有较好的修复作用，可防止小肠绒毛膜脱落变性，萎缩坏死，保护小肠上皮细胞的固有形态。推测其原因可能是在复方苦芩对肠黏膜修复作用的基础上，针灸治疗进一步发挥了调节全身免疫，增强机体肠黏膜屏障免疫功能的作用。

图8 各组对犬肠黏膜中IFN-γ的影响

IL-1主要由活化的巨噬细胞所产生，是发热和炎症的强诱导剂，具有诱导合成环氧合酶2型(COX-2)、2型磷脂酶A和诱导型一氧化氮合酶等强效炎症介质的作用[17]；IL-2主要由辅助性T细胞产生，它是T细胞必不可少的生长因子，对T细胞的增殖、效应细胞和记忆细胞的产生至关重要[18]；TNF-α主要是由巨噬细胞和单核细胞产生，是一种在正常和病理生物学过程中起重要作用的促炎细胞因子，在调节不同组织和复杂的细胞因子网络中起着至关重要的作用[19]。试验中，模型组的促炎因子IL-1、IL-2、TNF-α大量增加，治疗后各治疗组都有不同程度的下降，试验5 d后，基本都稳定在空白组的正常值左右，减轻了机体炎症。

当肠道受到CPV给的刺激后，肠黏膜固有层分泌大量的细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ等；IL-4主要由Th2细胞、先天淋巴细胞和髓系细胞产生，是B细胞的T细胞衍生生长因子[20]；IL-5由活化的Th2和肥大细胞产生，是炎症调节因子，能刺激嗜酸粒细胞增殖、分化及活化；对病原体的反应中具有细胞和组织特异性功能[21]。IFN-γ由Th细胞和NK细胞产生，它通过增强抗原的加工和提呈，增加白细胞的转运，诱导抗病毒状态，增强抗微生物功能，影响细胞增殖和凋亡等方面发挥其免疫调节作用[22]；IFN-γ属于促炎因子的一种，可启动炎症反应。本试验中，模型组抗炎因子IL-4、IL-5和促炎因子IFN-γ大量增加，在经过治疗以后，各药物组均有不同程度下降，说明复方苦芩结合针灸治疗可以有效的降低因CPV侵入机体破坏肠黏膜产生的大量细胞因子，促进抗炎因子与促炎因子恢复平衡，抑制炎症发展，减轻肠黏膜的炎性反应。

复方苦芩结合针灸治疗可提高犬细小病毒病的治愈率，恢复其肠黏膜的形态，降低血清以及肠黏膜的炎性因子，以达到对肠黏膜的修复。