茶多酚通过NF-κB通路缓解LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应

贾红豆

(黑龙江八一农垦大学 生物技术中心，黑龙江 大庆163319)

乳腺炎是奶牛中最常见的传染病之一。该病的特征是细菌和真菌感染引起的乳腺组织的炎症反应，导致牛奶产量和品质下降，从而给奶牛养殖业带来严重的经济损失[1-2]。此外，乳腺炎还存在治疗费用高昂和广泛的流行等问题，严重影响患病奶牛的福利和健康[3]。牛乳腺上皮细胞是牛奶蛋白合成和分泌的主要部位，也是抵抗病原细菌的主要防线。一旦病原菌进入乳房，就会诱导促炎性细胞因子产生，并且导致局部乳腺炎症。牛乳腺炎最常见的致病性病原体是革兰阴性菌大肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌以及革兰阳性菌无乳链球菌、乳房链球菌和金黄色葡萄球菌[4]。革兰阴性细菌释放的脂多糖(LPS)被认为是牛乳腺上皮细胞炎症的重要刺激因素[5-6]。研究发现，LPS可以激活NF-κB信号通路，诱导IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子的释放[7]。反过来，这些细胞因子进一步加重了与乳腺炎有关的病理和炎症反应。多年以来，乳腺炎的治疗主要采用抗生素治疗，早期效果良好，但随着时间的流逝，致病菌会在体内产生耐药性和更多的药物残留，严重危及奶牛及人类健康。此外，疫苗的预防效果不理想，对乳腺炎的预防和治疗也提出了更高的挑战，因此，迫切需要寻找和开发治疗奶牛乳腺炎的新药物。

近年来的研究发现，中药对奶牛乳腺炎性具有明显的治疗效果，而且能避免药物残留等问题。因此，筛选出具有治疗奶牛乳腺炎的中药，并阐明其作用机理具有十分重要的临床意义。茶多酚是绿茶提取物，含有许多生物学功能的关键成分，具有包括抗炎、抗氧化和抗癌等作用。研究发现，茶多酚可以通过抑制NF-κB通路发挥抗炎作用[8]。目前，茶多酚对奶牛乳腺炎是否具有防治作用尚不清楚，本试验通过研究茶多酚对奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的保护作用，并阐明其潜在的分子机制，为筛选治疗奶牛乳腺炎的药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂DMEM/F12培养基购自SIGMA(D8437-500ML)；CCK-8试剂盒购自Dojindo, Kumamoto(CK04)；IKKβ激酶活性检测试剂盒购自GenMed Scientifics Inc.(GMS50162.4)；RNAiso Plus购自TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.(D9108A)；反转录试剂盒购自TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.(RR047A)；蛋白裂解液购自Beyotime Institute of Biotechnology(P0013)；BCA试剂盒法购自Applygen Technologies(P1511)；p-IκB α购自 Santa Cruz Biotechnology(sc-271980)；IκBα购自 Santa Cruz Biotechnology(sc-166588)；p65购自Santa Cruz Biotechnology(sc-8008)；β-actin购自 Santa Cruz Biotechnology(sc-166748)；p-p65购自 Santa Cruz Biotechnology(sc-47778)。

1.2 试验分组与处理使用混有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃、5%CO2的条件下对奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)进行培养。(1)对照组:MAC-T细胞在无血清培养基中培养12 h，更换无血清培养基继续培养6 h。(2)LPS组:MAC-T细胞在无血清培养基中培养12 h，更换含有1 mg/L LPS无血清培养基培养6 h。(3)茶多酚组:MAC-T细胞在含有茶多酚(50，100，200 mg/L)的无血清培养基培养12 h，更换无血清培养基培养6 h；(4)茶多酚+LPS组：MAC-T细胞在含茶多酚(50，100，200 mg/L)的无血清培养基培养24 h，更换含1 mg/L LPS的无血清培养基培养6 h。

1.3 细胞活力检测使用CCK-8试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)检测细胞活力。将细胞10× 104个/mL接种于96孔板，细胞按照1.2处理后，添加CCK-8试剂孵育4 h，之后用酶标仪(Thermo Fisher Scientific,Grand 79 Island,NY)测D450 nm值。

1.4 IKK-β活性测定MAC-T细胞经处理后，IKK-β活性采用IKK-β激酶活性检测试剂盒(GMS50162.4;GenMed Scientifics Inc.,Wilmington,DE)方法进行检测。

1.5 RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCRMAC-T细胞经处理后，利用RNAiso Plus(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.,Dalian,China)提取细胞中的RNA，随后利用反转录试剂盒(RR047A,TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.)将RNA反转录成cDNA，之后采用7500 real-time PCR系统检测各目标基因的mRNA表达量。利用2-ΔΔCt计算目标基因的mRNA表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.6 蛋白提取和Western blotMAC-T细胞经处理后，使用蛋白裂解液(P0013,Beyotime Institute of Biotechnology,Jiangsu,China)提取总蛋白。采用BCA试剂盒法(P1511,Applygen Technologies,Beijing,China)检测蛋白质量浓度。使用SDS-PAGE分离蛋白质样品，并电泳转移到PVDF膜上，之后将PVDF膜与特异一抗(p-IκB-α，IκB-α，NF-κB，p-NF-κB和β-actin)及相应的二抗孵育后检测蛋白条带。

2 结果

2.1 茶多酚对MAC-T细胞活力的影响为了检测茶多酚对MAC-T细胞是否毒性作用，采用CCK-8试剂盒检测细胞活力。结果显示，50，100，200 mg/L茶多酚对MAC-T细胞的活力没有显著性影响(图1)。后续试验选用无毒性影响的中剂量100 mg/L 茶多酚。

图1 茶多酚对MAC-T细胞活力的影响

2.2 茶多酚对IKK-β活性的影响与对照组相比，LPS组细胞中IKK-β活性显著升高(P<0.05)；与LPS组相比，茶多酚+LPS组中IKK-β活性显著降低(P<0.05)(图2)。

*示P<0.05，下同

2.3 茶多酚对p-IκB-α、IκB-α、p-NF-κB和NF-κB蛋白表达量的影响与对照组相比，LPS组细胞中p-IκB-α/IκB-α比值显著升高(P<0.05)(图3A，B)。与LPS组相比，茶多酚+LPS组中p-IκB-α/IκB-α比值显著下降(P<0.05)(图3A，B)。与p-IκB-α/IκB-α变化趋势一致，LPS组细胞中p-NF-κB/NF-κB比值显著高于对照组(P<0.05)(图3A，C),而茶多酚+LPS组中p-NF-κB/NF-κB比值显著低于LPS组(P<0.05)(图3A，C)。

A.p-IκB-α、IκB-α、p-NF-κB和NF-κB蛋白条带；B.p-IκB-α和IκB-α的比值；C.p-NF-κB和NF-κB的比值

2.4 茶多酚对TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达量的影响与对照组相比，LPS组细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达量显著升高(P<0.05)；与LPS组相比，茶多酚+LPS组中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达量显著降低(P<0.05)(图4)。

A.TNF-α mRNA表达量；B.IL-6 mRNA表达量；C.IL-1β mRNA表达量

3 讨论

乳腺炎以乳腺组织损伤为特征，且促炎性细胞因子(主要是TNF-α、IL-6和IL-1β)水平升高。LPS是大肠杆菌的主要毒力因子，在奶牛乳腺炎的发病过程中发挥重要作用。据报道，NF-κB是介导LPS诱导炎性细胞因子产生的主要信号通路[9]。通常情况下，抗生素是治疗乳腺炎的主要药物，但是由于耐药性和残留物导致牛奶质量下降和产量下降。因此，寻求安全有效的抗炎药物是缓解奶牛乳腺炎的重要方法。茶多酚是茶叶提取物，因其具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等生物活性[8]，己被广泛应用于医药行业和兽医领域。本试验结果表明，茶多酚可以通过抑制NF-κB通路降低TNF-α、IL-6和IL-1β的产生而保护奶牛乳腺上皮细胞免受LPS诱导的炎性损伤。

炎性细胞因子的过度分泌在奶牛乳腺炎的发病过程中具有关键作用。细胞因子作为细胞间化学信使参与调节免疫稳态和炎症反应[10]。研究发现，大肠杆菌可导致奶牛乳腺炎诱导TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎细胞因子mRNA表达量增加[11]。体外LPS刺激乳腺上皮细胞也可以导致这些促炎细胞因子表达量上升[12-13]。因此，减少促炎性细胞因子的产生可能是治疗乳腺炎的有效策略。据报道，茶多酚可以降低大鼠心肌细胞中促炎细胞因子TNF-α mRNA表达量[8]。本试验结果表明，茶多酚预处理可以显著降低奶牛乳腺上皮细胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表达量，减少促炎细胞因子的产生而缓解LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应。

NF-κB蛋白是一种核转录因子，该蛋白的激活在乳腺炎的发展中具有十分重要的作用[14-15]。当细胞受到各种化学和机械信号刺激时，IKK-β被迅速激活，导致IκB-α磷酸化和蛋白酶体介导的降解[16]，然后将NF-κB磷酸化并转移到细胞核中，从而诱导细胞因子的转录[17]。因此，抑制NF-κB的激活可能是治疗乳腺炎的关键步骤。研究发现，茶多酚可以降低心肌细胞中NF-κB的结合活性[8]，从而减少促炎细胞因子的产生。本试验发现，茶多酚可以减少LPS诱导的IKK-β的活性，并降低IκB-α和NF-κB的磷酸化水平，从而抑制NF-κB信号通路的激活。这些结果表明，茶多酚预处理可改善LPS诱导的NF-κB通路的激活，这可能有助于缓解奶牛乳腺上皮细胞的炎性反应。

本试验结果表明，茶多酚可通过抑制NF-κB通路的激活而缓解LPS诱导的乳腺上皮细胞的炎性反应，说明茶多酚可能成为防治奶牛乳腺炎的药物。