大熊猫源产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定

苏小艳，李运莉，燕 霞，张东升，李 林，侯 蓉，岳婵娟，刘颂蕊*

(1.成都大熊猫繁育研究基地，四川 成都 610081;2.四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，四川 成都 610081;3.四川省大熊猫科学研究院，四川 成都 610081)

肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumonia，Kpn)属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，为革兰阴杆菌；作为一种人兽共患病病原，广泛分布于人和动物肠道以及自然环境中[1-7]。Kpn能引起典型的原发性肺炎，也能引起各种肺外的感染，如骨髓炎、泌尿道感染及败血症等[8-10]。超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)是由细菌质粒介导的一类酶，能赋予细菌对头孢菌素类、单酰胺类(氨曲南)及青霉素类抗生素耐药[11]。由于产ESBLs-Kpn菌株在携带ESBLs质粒的同时，常携带对其他抗生素如氟喹诺酮类、磺胺类、氨基糖苷类的多种耐药基因，故可造成多重耐药[12-13]。

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)是世界公认的濒危动物，是生物多样性保护的旗舰种，属于国家Ⅰ级保护动物，现分布于四川、甘肃、陕西三省山区。第4次大熊猫普查结果显示，全国野生大熊猫种群数量达1 864只[14]，目前全国圈养大熊猫种群数量达500只。在圈养大熊猫的疾病防控中会使用抗生素，其中包括β-内酰胺类抗生素。在人医及动物医学领域，专家学者对ESBLs-Kpn的临床分离株在耐药性、毒力基因和分子流行病学等方面进行了深入研究，这些研究结果为科学有效地防控超广谱ESBLs-Kpn都起到了积极作用。然而，对于大熊猫源ESBLs-Kpn的分子流行病学研究目前还处于空白状态。因此，本试验拟对大熊猫源ESBLs-Kpn进行分离鉴定，探究大熊猫源ESBLs-Kpn在圈养大熊猫中的流行情况和基因型，为临床合理使用抗生素提供科学依据，也为预防和控制此类细菌的传播提供系统的实验数据和参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理2018-2019年共收集某基地圈养大熊猫新鲜粪便390份；用灭菌镊子夹取少许粪便放入装有1 mL无菌生理盐水的无菌EP管中，充分震荡混匀后接种到脑心浸液(BHI)肉汤中扩菌培养。

1.2 菌株的分离培养与革兰染色将1.1中的BHI肉汤在无菌条件下接种到麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂培养基(MIAC，购自北京陆桥公司)上，37℃培养12～24 h后观察菌落形态特征。挑选较大、圆凸起、边缘红色中间粉白色的具有一定黏度的单菌落进行进一步纯化后于37℃摇床振荡进行单菌落扩增培养。挑取少许菌液进行革兰染色后观察菌体形态及染色特征。

1.3 分离菌株的分子生物学鉴定按照TIANGEN©细菌DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。用细菌基因组DNA作为模板，细菌16S rDNA基因通用引物(由生工生物公司合成)扩增细菌的16S rDNA基因，扩增产物大小为1 500 bp。引物序列为：上游引物27F：5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′，下游引物1 492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。配制PCR反应体系(25 μL)：模板DNA 2 μL，TaqMIX(2×)12.5 μL，上、下游引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸10 min。取扩增产物在110 V条件下，1%琼脂糖凝胶电泳30 min，并将PCR产物送至生工生物公司测序后在NCBI中比对，确定分离菌株的种属。

1.4 分离菌的同源性分析和系统发育树的构建GenBank中选取1株Kpn、3株肠杆菌科的不同属的16S rDNA序列和分离菌株的16S rDNA序列，使用MEGA 7.0软件，采用Neighbor-joining法绘制系统发育树并分析其同源性。

1.5 菌株的生化鉴定将纯化好的细菌接种于MH肉汤培养基中培养24 h，使用细菌微量生化反应管进行分离菌株的生化试验，其操作按文献[15]方法进行。

1.6 产ESBLs-Kpn菌株的表型鉴定将分离菌株按0.5麦氏浓度均匀涂布于MH平板上进行ESBLs初筛和确证试验，具体操作按文献[16]方法进行。

1.7 ESBLs-Kpn菌株的基因型鉴定将表型鉴定筛选出的阳性菌株采用TIANGEN®细菌基因组提取试剂盒提取菌株DNA。PCR反应体系(25 μL)：模板DNA 2 μL，TaqMIX(2×)12.5 μL，上、下游引物(各引物序列见表1[16])各1 μL、ddH2O 8.5 μL。扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，72℃延伸1 min，共30个循环，72℃延伸10 min，各退火温度见表1[16]。取扩增产物在110 V条件下，1%琼脂糖凝胶电泳30 min，将PCR产物送至生工生物公司测序后并在NCBI中比对，确定相应的基因型。

表1 ESBLs基因引物序列信息

2 结果

2.1 菌株的分离培养MIAC培养基上菌落，较大、圆凸起、边缘红色中间粉白色的具有一定黏度的菌落判定为疑似Kpn(图1A)；显微镜下观察菌体形态特征为两端钝圆长短不一的革兰阴性杆菌(图2B)。本试验从390份大熊猫新鲜粪便中根据形态和革兰染色初步判断出362株疑似Kpn菌株。

图1 分离菌株在MIAC培养基上的生长特征(A)和革兰染色特征(B,1 000×)

2.2 分离菌株的16S rDNA结果和系统发育进化树构建结果通过PCR扩增细菌16S rDNA，琼脂糖凝胶电泳检测在1 500 bp大小处出现条带(图2)，将该产物送生工生物公司测序后在NCBI数据库进行比对，选取相似度大于98%且为Kpn的结果。基因进化树分析结果显示，分离菌株与Kpn(NR036794.1)的同源性最高，与大肠杆菌(NR024570.1)和志贺菌(NR104901.1)同源性较低，表明该菌株为Kpn(图3)。对362株疑似Kpn菌株进行16S rDNA鉴定并构建系统发育进化树进行同源性分析鉴定出211株Kpn。

M.DL2000 DNA Marker;1.为生理盐水作为阴性对照;2～9.样品

图3 部分分离菌株16S rDNA基因序列发育进化树

2.3 生化鉴定结果通过微量生化反应管对211株菌株进行生化测定，结果如表2所示，分离菌株能发酵麦芽糖、蕈糖、蔗糖、甘露醇、产酸产气；尿素、葡萄糖试验结果呈阳性；硫化氢、乳糖试验呈阴性。将生化试验结果比对伯杰细菌鉴定手册[15]，判定211株分离菌株均为Kpn。

表2 分离菌株的生化试验结果

2.4 ESBLs-Kpn的表型鉴定结果确定为Kpn后通过初筛试验和确证试验对ESBLs-Kpn进行表型鉴定。初筛试验中，从211株Kpn中鉴定出31株疑似ESBLs-Kpn(表3和图4A)。31株疑似阳性菌ESBLs确证试验结果显示，菌株编号为3,30,31的菌株鉴定为ESBLs阳性菌株，分离率为1.42%(表4和图4B)。对3株ESBLs-Kpn菌株采用PCR技术进行基因型鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测在CTX-M(593 bp)、CTX-M-1(415 bp)、TEM(800 bp)、SHV(713 bp)处出现条带(图5)；CTX-M2、CTX-M8、CTX-M9、CTX-M25、GES、PER、VEB、OXA-1、OXA-2在相应大小处未出现条带。将阳性产物送生工生物公司测序后在NCBI数据库中进行比对确定基因型得出，3号和31号菌株基因型为blaSHV+blaTEM+blaCTX-M-1，30号菌株基因型为blaSHV+blaCTX-M-1。

M.DL2000 DNA Marker;1.3号样品;2.31号样品;3.30号样品;4.阴性对照

表3 ESBLs-Kpn初筛试验结果

表4 ESBLs-Kpn确证试验结果

CRO.头孢曲松;CTX.头孢噻肟;CAZ.头孢他啶;CTX/CAL.头孢噻肟/克拉维酸

3 讨论

Kpn可引起大熊猫肠炎和败血症[17-18]。ESBLs则是由质粒介导的一种β-内酰胺酶，可以抑制多数青霉素和头孢菌素，在临床上增加了Kpn感染后治疗的难度。本试验从390份大熊猫新鲜粪便中通过MIAC选择培养基分离出362株疑似Kpn菌株，通过PCR扩增细菌16S rDNA片段后测序比对，结合生化鉴定管结果最终鉴定出Kpn 211株，这提示大熊猫肠道中普遍存在Kpn；对这211株Kpn种进行ESBLs初筛和确证试验，最后分离出3株ESBLs表型阳性的Kpn，分离率为1.42%。在医院临床样本中，ESBLs-Kpn的分离率为24%～35%[19-20]，而在大熊猫圈养种群中，ESBLs-Kpn的分离率远远低于人类医学临床样本，出现这种现象可能有2个方面：一是人类医学临床样本来自于可能已经接受了抗生素治疗的患病个体导致菌体耐药性增加，而本研究中收集的样本绝大部分为正常大熊猫个体粪便；二是在大熊猫细菌感染的临床治疗过程中，抗生素的使用频率和种类可能明显少于人类。但是，在大熊猫圈养种群中已出现了ESBLs-Kpn，因此，在圈养大熊猫临床治疗过程中应合理使用抗生素以避免ESBLs菌株的进一步增加。

全球目前已经发现200多种ESBLs基因型[21]。根据各个酶特性的不同，大致分为SHV型、CTX-M型、TEM型、OXA型和其他类型，如PER、VEB、GES、SPO等[22]。由于抗菌药物的使用差异及菌株流行的原始地域性差异，所以不同地区流行的ESBLs基因型和耐药特征都存在一定的差异[9]。西班牙产ESBLs菌株具有高度多样性，但以CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14及TEM-4型最多见[23]；英国以TEM-10和TEM-12为主[24]；韩国以SHV-12、TEM-52和SHV-2a为主；OXA型主要分布于法国及土耳其；美国则常见的为CTXM14、CTX-M-9、CTX-M-3和SHV-12等；我国的ESBLs以CTX-M型及SHV型为主[25-26]。本试验中所分离的ESBLs-Kpn基因型主要表现出混合基因型的特征，即2株ESBL-Kpn基因型为blaSHV+blaTEM+blaCTX-M-1，1株的基因型为blaSHV+blaCTX-M-1，且均含有CTX-M和SHV基因型，说明在圈养大熊猫中出现的ESBLs基因型与国内人群中流行的ESBLs基因型有高度的一致性。

综上可知，本试验从390份大熊猫新鲜粪便中分离出3株ESBLs-Kpn阳性菌株且表现出混合基因型的特征，由此说明ESBLs-Kpn菌株已在大熊猫圈养种群中出现。鉴于ESBLs-Kpn菌株感染后的治疗难度和造成的危害，在大熊猫等野生动物的临床治疗中应合理使用抗生素，以避免ESBLs-Kpn菌株的进一步增加。