鹦鹉源禽博尔纳病毒的鉴定及全基因序列分析

翟俊琼，单 芬，李婉萍，周 妞，罗满林，陈 武*

(1.广州动物园 广州市野生动物研究中心，广东 广州 510070；2.华南农业大学 兽医学院，广东 广州 510642)

禽博尔纳病毒(avian Borna virus，ABV)是单股、不分节段的负链RNA病毒[1]，基因组全长8.9 kb，病毒粒子呈球形，直径约90 nm[2]，基因组编码6种蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、与磷蛋白重叠的小蛋白(X)、基质蛋白(M)、包膜蛋白(G)和RNA依赖的RNA聚合酶(L)[3]。2008年，ABV首次被鉴定为引起一种致命的鹦鹉神经疾病-腺胃性扩张症(proventricular dilatanon disease,PDD)的病原体[4-5]；随后，在水禽和鸣禽中也发现该病毒[6-10]。到目前为止，已经从超过80种鸟类、50种鹦鹉上检测到8种不同基因型ABV[11-15]。ABV主要引起患病鸟类出现腹部肿大、体质量减轻、消化不良、共济失调等症状，病死率很高，导致大量圈养鸟类包括濒危物种的死亡，对养殖业以及供观赏类的服务业造成极大威胁[16-17]。目前，还没有有效的方法来治疗ABV感染，只能进行对症治疗和管理[12,18]。

国内对鹦鹉源禽博尔纳病毒(parrot Bornavirus，PaBV)的相关报道甚少[19]，本试验通过观察疑似感染ABV的鹦鹉生前体征、死后剖检、病理切片以及RT-PCR检测PaBV核酸，最终证实鹦鹉感染PaBV；选取1份阳性样本扩增全基因组序列，通过分析其遗传进化关系和核苷酸同源性，了解该毒株的亲缘关系及流行趋势，为我国PaBV的防控提供一定的理论基础和参考。

1 材料与方法

1.1 病料收集于上海、成都、广州、佛山等养殖场的死亡鹦鹉,其中太阳锥尾鹦鹉4只、琉璃金刚鹦鹉1只、蓝眼巴丹鹦鹉2只、黄头亚马逊鹦鹉1只、红绿金刚鹦鹉1只和灰鹦鹉1只。

1.2 主要试剂病毒RNA抽提试剂盒购自AXYGEN，反转录试剂盒、pMD19-T载体、E.coliDH5α感受态细胞购自TaKaRa，胶回收试剂盒购自OMEGA，PCR反应酶购自Thermo Fisher。

1.3 疑似PaBV感染的临床症状以及病理观察观察并记录疑似PaBV感染的鹦鹉生前症状以及死亡剖检变化，并取病变较严重的组织做病理切片观察。

1.4 引物的设计与合成参照GenBank上发表的PaBV序列，设计合成1对用于扩增PaBV的通用引物(PaBV-F和PaBV-R)和用于扩增PaBV4的全基因序列引物7对(表1)。

表1 RT-PCR扩增所用的引物

1.5 PaBV的RT-PCR检测取疑似感染ABV的鹦鹉腺胃、脑，参照病毒RNA/DNA抽提试剂盒说明书提取经研磨的组织RNA/DNA。根据TaKaRa反转录试剂盒说明书，将提取的病毒RNA反转录成cDNA，使用检测引物PaBV-F和PaBV-R进行检测。PCR反应体系：Mix 12.5 μL,PCR Forward Primer 1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，cDNA 1 μL，Nuclease-free Water 9.5 μL。反应程序：95℃ 4 min；95℃ 30 s，55℃(根据各引物而定)30 s，72℃ 45 s(1 kb/min)，35个循环；72℃ 10 min。1%电泳观察试验结果，并将阳性产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序，将测序结果通过NCBI上的Blast比对，看是否与PaBV最接近，然后下载各个不同基因型的PaBV序列，建立遗传进化树进行分型。

1.6 全基因组的克隆与测序同1.5方法，以反转录的cDNA为模板，分别用引物PaBV-4-F1/PaBV-4-R1～PaBV-4-F7/PaBV-4-R7进行全基因序列扩增，电泳观察结果。切胶回收阳性条带，将产物与pMD19-T进行连接，转化至DH5α感受态细胞，挑取单菌落，将鉴定为阳性的菌液送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.7 序列比对与分析将全基因测序结果通过NCBI的BLAST进行比对，观察其是否是PaBV-4的序列，正确序列进行拼接，将得到的PaBV-4全基因序列上传至NCBI，获得登录号。从NCBI上下载PaBV相关序列，应用DNAStar和MEGA6.06软件对PaBV各个基因型进行同源性比较和遗传进化分析。

2 结果

2.1 临床症状以及病理观察结合临床症状和剖检变化(表2)，初步怀疑为PaBV，后进一步进行实验室诊断。取病变较严重的腺胃(琉璃金刚鹦鹉)做病理切片观察，腺胃黏膜上皮细胞变性坏死，可见大量炎细胞浸润，胃腺结构紊乱(图1)。

表2 临床症状和剖检变化

图1 死亡鹦鹉腺胃病理切片图

2.2 PABV的RT-PCR检测与分型PCR产物进行凝胶电泳，结果显示扩增出约350 bp条带(图2)，与目的基因大小相符，将产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序，序列比对结合进化树分析(图3)证实10只鹦鹉中有6只感染PaBV，其中4只太阳锥尾鹦鹉和1只蓝眼巴丹鹦鹉例感染PaBV-4，1只琉璃金刚鹦鹉感染PaBV-5，其余4只检测均呈阴性，排除ABV(表3)。

表3 10只鹦鹉PaBV检测情况

M.DL2000 DNA Marker；1～8.样品cDNA扩增产物

图3 基于M基因部分序列的遗传进化分析

2.3 全基因组的克隆与测序通过RT-PCR方法分7个片段扩增被鉴定为PaBV-4的全基因组，电泳得到预期大小目的条带(图4)，切胶回收目的片段，将回收产物与pMD19-T载体进行连接，转化至DH5α进行单菌落摇菌培养，将鉴定为阳性的菌液送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。拼接获得的7个片段，得到PaBV-4 GZ 2019株全长8 915 bp的基因组，与GenBank上公布的PaBV-4基因组大小一致，将该序列上传至GenBank，得到登录号为MT258650。

1～7.分别为引物PaBV-4-F1/PaBV-4-R1～PaBV-4-F7/PaBV-4-R7的扩增产物；M.DL2000 DNA Marker

2.4 序列分析

2.4.1同源性分析 应用DNAStar软件里的MegAlign对本研究中获得的PaBV-4全基因序列与GenBank上下载的13个毒株的PaBV序列(部分序列接近全基因)进行同源性比较，结果(图5,6)显示，本试验所得到的GZ 2019毒株与参考的13个毒株的核苷酸相似性为64.8%～99.6%，氨基酸相似性为68.7%～99.8%。其中，与同为PaBV-4的4个参考毒株的核苷酸相似性为94.7%～99.8%，氨基酸相似性为98.0%～99.8%；与2009年从美国蓝黄金刚鹦鹉大脑检测的PaBV-4毒株NM_20(接近全基因)核苷酸相似性最高，为99.6%；与2008年从德国蓝黄金刚鹦鹉检测的PaBV-4毒株6758氨基酸相似性最高，为99.8%；与2015年从美国的凤头鹦鹉检测到的PaBV-5毒株Cockg5相似性最低，核苷酸相似性为64.8%，氨基酸相似性为68.7%。

2.4.2遗传进化分析 应用MEGA6.06软件对本试验获得的PaBV-4全基因序列与GenBank上下载的13个毒株的PaBV序列(部分序列接近全基因)进行遗传进化分析(图7)，结果显示GZ 2019病毒株与M14、AG5、6758亲缘关系最近，同属一个小的分支，其次是NM_01，与PaBV-5各分离株亲缘关系最远。

图6 本试验获得的PaBV-4与参考的13株PaBV氨基酸序列同源性比较

图7 基于全基因序列的遗传进化树

3 讨论

自2008年首次在腺胃扩张症的鹦鹉中发现ABV以来，其多感染鹦鹉、金丝雀等鸟类[20]，病死率高，使各类珍禽受到很大威胁。由于广泛的商贸活动，使得ABV在鸟类中持续传播，到目前为止，在世界各国广泛分布，巨嘴鸟、加拿大鹅、鸵鸟、番鸭、猫头鹰、鹜、密雀、织雀及其他雀形目鸟类已经检出该病毒，家禽中鸭、鹅、鸽也携带该病毒，甚至棕尾虹雉也发现感染PaBV-4[21]。有研究表明，ABV可通过分泌物排出，因此粪便、尿液甚至羽毛污染物被认为是可疑的污染源[6,13]，粪便、羽毛也是最易获取的样本。然而也有研究证实，鸟类只是间歇性传播该病毒[13]，因此应多次采样进行检测才能有效减少假阴性。本试验是通过检测死亡鹦鹉的脑和腺胃来判断有无感染ABV，若后续对群体进行该病毒的监测，可多次取粪便、羽毛作为样本进行检测。腺胃扩张症、神经症状是PaBV感染的典型症状[22-23]，在本试验中，多数检测到ABV阳性的鹦鹉表现出腺胃扩张、撞墙等症状。不同地区ABV流行毒株序列分析显示，各毒株有发生基因突变，但不同基因型的地理分布还未发现规律性，PaBV共有8个不同基因型，有研究报道，以PaBV-2、PaBV-4较常见[4,6,11,24]，本试验中检测到的6例，通过基因分型显示(图2)有5例为PaBV-4型，仅1例为PaBV-5型，这可能与采样数量和地域有关，其流行病学还有待进一步研究调查。

到目前为止，国内有报道鹦鹉感染ABV的案例，但仅限于检测，本试验对检测到的PaBV同时进行了分型，并对检测到的1株PaBV-4进行全基因测序和分析，结果显示GZ 2019株全基因组全长8 915 nt，编码6种蛋白，与NM_20株核苷酸同源性最高，仅相差35个核苷酸，与6758株氨基酸同源性最高，相差6个氨基酸，同源性比较结果显示，GZ 2019毒株与同为PaBV-4的4个参考宿主核苷酸相似性为94.7%～99.8%，氨基酸相似性为98.0%～99.8%，说明该毒株具有较高的保守性，这一结果与参考文献[23]的结果一致。遗传进化分析显示，GZ 2019毒株与M14、AG5、6758亲缘关系最近，可能由同一祖先进化而来。

总之，本试验丰富了国际上关于PaBV的流行病学数据，为后续更深入的研究该病毒的诊断方法、疫苗研发以及致病机理奠定了良好的试验基础。