兔轮状病毒、兔肠冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

赵巧雅，宋丹丹，刘丽萍，郭效珍，刘存霞，盛 媛，史玉颖，黄 兵*

(1.山东省农业科学院 家禽研究所，山东 济南 250023；2.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018)

兔轮状病毒(lapine rotavirus，LaRV)是呼肠孤病毒科轮状病毒属，可感染各日龄兔尤其是1～2月龄幼兔[1]，造成腹泻[2]。该病传播迅速，发病急、发病率高，四季均可发生。兔肠冠状病毒(rabbit enteric coronavirus，RECV)为冠状病毒科冠状病毒属病毒，最早于1980年在加拿大腹泻症状幼兔身上发现[3]，后在健康兔中也观察到该病毒[4]。两者均是引起仔兔腹泻的重要病原，临床症状极为相似且存在混合感染情况，仅仅根据临床上的方法难以进行鉴别和诊断。目前，已有RT-PCR、荧光定量RT-PCR及LAMP等方法对牛轮状病毒[5]、猪轮状病毒[6]、牦牛源轮状病毒[7]、猪冠状病毒[8]、大鼠冠状病毒[9]等进行检测，而关于LaRV和RECV的双重RT-PCR检测方法在我国尚未见报道。

轮状病毒基因组编码6种结构蛋白和5种非结构蛋白。NSP3基因较为保守，人轮状病毒[10]、猪轮状病毒[11]等均针对NSP3基因建立了相关检测方法。N蛋白是一种碱性磷蛋白，是冠状病毒粒子主要结构蛋白之一，既具有高度保守性,又具有很强的免疫原性，在病毒RNA合成中发挥作用[12]，常用于抗原检测[13]。据报道，检测临床样本时N基因检测的灵敏度比ORF1b基因高10倍左右[14]。因此，本试验针对轮状病毒的NSP3基因、冠状病毒N基因设计特异性引物，建立了LaRV和RECV双重RT-PCR检测方法，并在山东部分规模化兔场采集样品进行检测，为LaRV和RECV的疫情监控、临床检测及流行病学提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品、病毒及菌株2020年4-7月，从10个山东规模化兔场采集107份腹泻兔粪便样品，所有样品单独分装，4℃保存送至实验室检测。LaRV(J20180417)、RECV(J20190039)及兔瘟(rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV--J20181263)、大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli--CPCC120001)、魏氏梭菌(Clostridiumwelchii，Cl.welchii-J20171208)、沙门菌(Salmonella，SE-CMCC-50041)、泰泽氏菌(Bacilluspiliformis，BP-J20160243)、巴氏杆菌(Pasteurella，PS-BNCC132368)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus--CPCC140575)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa，PA-ATCC9027)、链球菌(Streptococcus，SS-BNCC102637)、支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica，Bb--J20180503)阳性样品均为标准菌株或由本实验室鉴定保存。

1.2 主要试剂DL2000 DNA Marker、PCR试剂盒、反转录试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品；pMD18-T克隆载体购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司。

1.3 引物设计与合成根据GenBank上发表的LaRV和RECV病毒的保守序列，利用Premier 5.0软件对该2种病毒的基因保守区域分别设计1对引物，预计扩增LaRV的NSP3基因部分片段291 bp，预计扩增RECV的N基因部分片段163 bp。引物由华大基因生物科技有限公司合成，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.4 核酸提取及反转录LaRV、RECV、RHDV阳性样品及临床样品(用生理盐水按1∶10混悬)4℃、8 000 r/min离心5 min，上清用于核酸提取。病毒RNA的提取参照提取试剂盒说明书进行，cDNA的反转录参照反转录试剂盒说明书进行，产物-20℃保存。细菌阳性样品参照提取试剂盒提取核酸，产物-20℃保存。

1.5 PCR扩增对反应的引物、模板等用量进行优化和多重重复试验后确定最佳反应体系。取5 μL扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 特异性试验利用本试验建立的反应体系分别对LaRV和RECV、RHDV、E.coli、Cl.welchii、SE、BP、PS、S.aureus、PA、SS、Bb阳性样品的核酸及水进行RT-PCR扩增，并电泳验证。

1.7 敏感性试验将阳性样品进行单一RT-PCR扩增，回收RT-PCR扩增产物，分别与pMD18-T载体连接，构建阳性质粒，并测定阳性质粒的浓度，LaRV和RECV单一质粒测定浓度后，将阳性质粒10倍梯度稀释后进行多重RT-PCR的敏感性试验。

1.8 临床样品检测用本试验建立的方法对2019年以来从山东部分地区采集的107份兔腹泻样品进行检测，并与单一RT-PCR检测结果进行比较。

2 结果

2.1 双重RT-PCR体系的构建及优化对退火温度及引物浓度等条件进行优化，当LaRV和RECV引物终浓度均为0.125 μmol/L、退火温度为52℃、模板比例为1∶1时，2条扩增条带均清晰。最终确定该多重RT-PCR体系：Premix Taq 10 μL，LaRV和RECV的上、下游引物各0.25 μL，模板1 μL，无菌去离子水补足至20 μL。最佳反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 20 s，52℃ 20 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。

以LaRV和RECV的混合质粒为模板，用建立的多重RT-PCR同时扩增，以水做阴性对照。结果显示，双重RT-PCR分别扩增出约291 bp和163 bp的目的片段(图1)。扩增的目的片段均经测序验证。

M.DL2000 DNA Marker；1.LaRV、RECV双重RT-PCR产物；2.LaRV单一RT-PCR产物；3.RECV单一RT-PCR产物；4.阴性对照

2.2 特异性试验用本试验建立的双重RT-PCR方法检测兔常见腹泻病原的阳性样品,结果显示具有良好的特异性(图2)。

M.DL2000 DNA Marker；1.LaRV、RECV双重RT-PCR产物；2.阴性对照；3.J20181263；4.CPCC120001；5.J20171208；6.CMCC50041；7.J20160243；8.BNCC132368；9.CPCC140575；10.ATCC9027；11.BNCC102637；12.J20180503

2.3 敏感性试验本试验所建立的双重RT-PCR对LaRV的最低检出限为2.73×105拷贝/μL,对RECV的最低检出限为1.22×104拷贝/μL(图3)。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.LaRV 2.73×1011～104 拷贝/μL，RECV1.22×1011～104 拷贝/μL；9.阴性对照

2.4 临床样本检测分别用建立的双重RT-PCR和单一RT-PCR对107份样品进行检测，部分检测结果见图4。结果显示，LaRV的阳性样品11份，阳性率为10.28%；RECV 的阳性样品8份，阳性率为7.48%；并检出共感染的样品2份，阳性率为1.87%(表2)。双重RT-PCR与单一RT-PCR对比，检测结果一致，符合率100%。

表2 临床样品的检测结果

M.DL2000 DNA Marker；1～12.临床样品(3-8、3-9、3-10、4-1、4-2、4-3、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-9)；13.阴性对照

3 讨论

兔轮状病毒和兔肠道冠状病毒作为一种急性消化道传染病，均可导致仔兔腹泻。发病率高且较难根除[15]，易与大肠杆菌病、魏氏梭菌病等相混淆[1]，仅靠临床鉴别诊断难以作出判定。目前国内尚未报道关于兔轮状病毒、冠状病毒的双重RT-PCR检测方法，传统的检测方法如电镜观察[16]、病毒分离鉴定[17]、RNA聚丙烯酰胺电泳(RNA-PAGE)[14]、血清学试验[15]等存在费时费力、特异性差、试验周期长等不足[18]，因此快速准确的诊断技术对该病显得尤为重要。本试验建立的双重RT-PCR方法，能够同时检测2种病原，且特异性良好。该方法对LaRV的最低检出限为2.73×105拷贝/μL、对RECV的最低检出限为1.22×104拷贝/μL，敏感性较高。应用本方法对临床样品检测，共检出17份阳性样品，与单一RT-PCR检测相比符合率100%，表明本方法在对临床样品检测中具有良好的应用价值。

有关其他种源轮状病毒、冠状病毒相关多重RT-PCR的检测方法已有相关报道。王文佳等[19]建立的牛冠状病毒、牛诺如病毒和牛嵴病毒多重PCR方法中对BCoV的检出限为9.51×105拷贝/μL；韩丽等[20]建立的猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法对冠状病毒检出限为3.14×103拷贝/μL；蒲翠敏等[21]在PEDV、TGEV和PoRV三重PCR检测方法中对轮状病毒的检出限为1×103拷贝/μL。结果表明，本试验建立的检测方法敏感性良好。

关于兔其他腹泻病原及其他常见病原的相关检测方法的报道，许国洋等[22]建立了铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测方法，林颖峥等[23]建立了兔病毒性出血症的快速检测方法。本研究建立的检测方法弥补的兔轮状病毒、冠状病毒检测方法的缺乏，可以为该2种病原的快速检测和流行病学调查等研究提供有力的技术支持。