牡荆提取物主要化学成分分析及自由基清除能力

向 蓉，舒柄垚，高 原，李亚晖，魏光伟,2，唐兴刚,2，郭伟干,2，罗胜军,2*

(1.广东省农业科学院动物卫生研究所，农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,广东省中兽药工程技术研究中心，广东 广州 510640；2.广东省前沿动物保健有限公司,广东 广州510550；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东 茂名 525000；4.珠海市启信达生物科技有限公司，广东 珠海 519000)

2019年农业农村部第194号公告正式发布，规定自2020年1月1日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，正式开启了我国饲料禁抗新纪元。因此，寻找饲用抗生素的高效替代产品成为目前当务之急。天然植物因具有多种活性物质和营养成分，能全面调节机体的生理功能[1-3]、提高动物生产性能[4-5]、增强机体免疫力[6-7]、提高饲料转化率[8]，且有天然环保无残留，毒副作用小等优点[9]，在养殖中已有大规模使用，成为替抗产品最佳选择之一[10]。

牡荆(Vitexnegundo L.var.cannabifolia(Sieb.et Zucc.) Hand.-Mazz.)是一种传统的药用植物，属于马鞭草科(Verbenaceae)牡荆属(Vitex)。人们对牡荆属其他植物如蔓荆、黄荆、穗花牡荆等进行了大量研究，发现牡荆属植物大多具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性[11-14]。但是目前对牡荆的研究报道较少，已有报道大多集中于对牡荆子的化学成分和生物活性的研究上[15]，而对于牡荆枝、叶的基础研究及其应用的报道还较少。牡荆的开发利用主要集中在人医，由牡荆叶提取的挥发油制成的油胶丸已载入中国药典[16]，但在兽医领域的应用还是一片空白。本课题组在前期动物试验基础上发现牡荆提取物有较好的抗腹泻作用。鉴于此，本研究利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS)技术对牡荆水提物和醇提物进行化学成分分析，并通过DPPH自由基清除能力测试评价两种提取物的抗氧化能力。以期了解其主要活性成分及体外抗氧化能力，为牡荆作为中兽药及饲料添加剂在养殖业中进一步开发利用提供基础理论支撑。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂牡荆采自广东省广州市，经华南农业大学郭世宁教授鉴定为马鞭草科牡荆属植物牡荆。药材采集后切成小段，经50℃烘干后，用中药粉碎机粉碎成粗粉，过20目筛，备用；无水乙醇(分析纯A.R.)、抗坏血酸(Vc)均购自国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ,DPPH)购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器和设备离子淌度-Q-TOF高分辨液质联用仪(Synapt G2-Si),美国Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm),美国Waters公司；酶标仪(EL×800)，美国BioTek公司；超纯水系统(Moldene 1820a)，重庆摩尔实验仪器有限公司。

1.3 牡荆提取物的制备牡荆水提物的制备：称取5 g牡荆粉于圆底烧瓶中，加入50 mL超纯水(料液比1∶10)，加热煮沸回流提取1 h后抽滤，收集滤液并再次向滤渣中加入50 mL超纯水煮沸1 h，合并2次滤液定容至100 mL，4℃保存待用。

牡荆醇提物的制备：称取5 g牡荆粉于圆底烧瓶中，加入50 mL 不同浓度乙醇煮沸回流提取1 h，抽滤后再次向滤渣中加入50 mL 相同浓度乙醇提取1 h，合并2次滤液定容至100 mL，4℃保存待用。乙醇浓度分别采用95%，80%，70%，60%，50%，获得对应浓度的醇提物。

1.4 DPPH自由基清除试验溶液的制备待测溶液的制备：用水和无水乙醇分别稀释牡荆水提液和醇提液，水提液分别稀释至生药质量浓度为1.500，1.000，0.500，0.250，0.125 g/L；95%醇提液分别稀释到5.000，4.000，3.000，2.000，1.000 g/L；80%醇提液分别稀释到3.000，2.500，2.000,1.000,0.500 g/L；70%醇提液、60%醇提液、50%醇提液均稀释至2.000，1.500，1.000，0.500，0.250 g/L。

DPPH溶液的制备：精密称取4.000 mg DPPH粉末，用无水乙醇溶解定容至10 mL，得质量浓度为0.400 g/L的DPPH母液，4℃避光保存备用；使用时以无水乙醇稀释为0.080 g/L的工作液。

Vc溶液的制备：精密称取8.000 mg Vc，用无水乙醇溶解制成0.800 g/L的Vc母液，依次用无水乙醇稀释为质量浓度分别为0.020，0.015，0.010，0.005，0.002 g/L的Vc对照液。

1.5 液相色谱条件以0.1%甲酸水溶液为流动相(A)，以0.1%甲酸乙腈为流动相(B)，梯度洗脱为0～1.0 min，2% B；1.0～25.0 min，98%～5% B；25.0～32.0 min，5% B；32.0～32.2 min，5%～98% B；32.2～35.0 min，98% B。柱温40℃，流速0.3 mL/min，梯度洗脱(A.水；B.乙腈,均含0.1%甲酸)

1.6 质谱条件电离方式：+/- ESI离子扫描模式；毛细管电压：2.5 kV；锥孔电压：35 V；源温度：120℃；脱溶剂气温度：350℃；气帘气：40 L/h；脱溶剂气：750 L/h；雾化气：6.500 Bar。

1.7 DPPH自由基清除试验试验方法参考文献[17]，以Vc为阳性对照组，在96孔板中分别加入不同浓度的牡荆提取液稀释液和100 μL DPPH自由基工作液，每个浓度设置3个复孔。将96孔板放入酶标仪中振荡1 min后室温、避光静置30 min，在517 nm处测定D值，计算各组自由基清除率，并计算IC50值。

清除率(%)=[1-(D样品-D本底)/D空白] ×100%

D样品为供试品与DPPH反应后的吸光度值；D本底为供试品中未加 DPPH反应液时的吸光度值；D空白为溶剂与DPPH反应后的吸光度值。

2 结果

2.1 UPLC-MS分析结果本研究对牡荆70%醇提液和水提液进行了UPLC-MS分析，采用正负离子扫描模式，其正、负离子流图分别如图1，2所示。

A.牡荆醇提液离子流图;B.牡荆水提液离子流图

A.牡荆醇提液离子流图;B.牡荆水提液离子流图

通过对一级质谱数据进行分析，在醇提液和水提液中共检测出77种化合物的信息，其中水提液和醇提液共有的化合物有44种，醇提液独有的有22种，水提液独有的有11种。

2.2 牡荆提取物主要化学成分分析结合二级质谱数据、MassBank数据库以及参考文献等，共确定22种化合物的结构信息，主要包括酚酸类、黄酮类以及环烯醚萜类等化合物。如表1所示，其中黄酮类化合物有11种(表1中8～12，14，17，19～22)，酚酸类化合物有8种(表1中2～3，5～7，15～16，18)，环烯醚萜类3种(表1中1，4，13)。

表1 牡荆提取液中化合物离子结构信息

续表1

续表1

2.3 DPPH自由基清除能力评价不同浓度的牡荆水提液及醇提液均具有一定的DPPH自由基清除能力，IC50结果如表2所示。牡荆醇提液的IC50值随提取时醇浓度的升高反而降低，而牡荆水提液清除DPPH自由基的IC50值为生药质量浓度0.860 g/L，显著低于牡荆醇提液，说明牡荆水提液的抗氧化能力强于醇提液。

表2 不同牡荆提取液对DPPH自由基清除能力

3 讨论

牡荆属植物大多为药用植物，具有多种活性成分。李春正等[18]对国内外牡荆属植物的化学成分进行综述，已从牡荆属植物中分离出206种化合物。近年来国内外关于牡荆属植物化学成分的研究报道也越来越多，该属植物新发现了多种化合物。徐尧等[19]从蔓荆子乙醇提取物中分离得到15个化合物，其中(E)-3,3′-二甲氧基-4,4′-二羟基二苯乙烯、(8R)-evofolin B、覆盆子酮、苄基-β-D-葡糖苷、云杉苷和4-(4′-羟基苯基)-2-丁酮-4′-O-β-D-吡喃葡糖苷为首次从牡荆属植物中分离得到。NIU等[20]在荆条叶70%醇提物中分离鉴定出10种环烯醚萜类化合物，其中化合物1号nishindacin A和2号isonishindacin A 为新发现的环烯醚萜类化合物。SICHAEM等[21]从荆条叶中分离出vitexnegundin，牡荆内酯，vitetrifolin D等9种化合物，其中vitexnegundin为一种新的半日花烷型二萜类化合物。但是目前对牡荆的相关研究大多集中于牡荆子的化学成分和生物活性，而对于牡荆枝、叶的基础研究及其应用的报道还较少。本研究基于液质联用技术对牡荆化学成分进行分析，从牡荆细枝和叶的不同溶剂提取液中共分离出77种化合物，鉴定出了其中22种化合物的结构，主要有黄酮类、酚酸类和环烯醚萜类等物质，牡荆醇提液和水提液均含有这几类物质，但从总离子流图来看牡荆水提液中总的物质种类少于醇提液。从已比对出的疑似化合物成分看，牡荆中含有较多的黄酮类和酚酸类化合物，以牡荆素为代表的黄酮类化合物能显著提高动物生产性能，提高动物机体抗病力，改善动物机体免疫机能。酚酸类化合物主要是绿原酸及其衍生物。绿原酸已被报道是一种具有抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒、降糖降脂等多种功能的生物活性物质[22]，应该在牡荆的生物学功能中发挥重要作用。因受参考文献和查阅数据库的限制，本研究中比对出的疑似化合物数量有限，其余成分的确定有待进一步分析，单体化合物的验证也需要下一步试验。

利用天然植物提取物作为体外抗氧化剂已成为食品、化工、医药等领域的研究热点。目前大量研究发现酚酸类[23]、黄酮类[24]、皂苷类[25]、多糖类[26]等化合物均具有较好的抗氧化活性。本研究以DPPH法研究牡荆不同浓度醇提液和水提液的抗氧化活性。发现不同浓度的牡荆醇提液和牡荆水提液均具有一定的抗氧化活性，牡荆水提液具有较好的清除DPPH自由基的能力，其IC50值为生药质量浓度0.860 g/L。醇提液清除DPPH自由基的能力显著低于水提液，且随着醇浓度的升高而降低。这说明牡荆中主要的抗氧化活性物质更适合水提方法进行提取。从前述化学成分研究发现酚酸类、黄酮类物质是其主要活性成分，大量的研究也证实酚酸类物质如绿原酸、黄酮类物质均具有较好的抗氧化活性。

本研究对牡荆中的化学成分及其抗氧化能力进行初步分析，有助于了解其潜在的生物活性，同时为其后续的进一步研究利用提供物质成分方面的基础支撑。