脑源性神经营养因子(BDNF)在李斯特菌感染山羊中枢神经系统的表达

李国生，彭瑞妮，郑文亚，刘 犇

(1.宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000; 2.江西绿科农牧科技有限公司，江西 宜春 336000; 3.江西省高等学校硒农业工程技术研究中心，江西 宜春 336000)

单核增生李斯特菌(Listeriamonocytogene,LM)是一种好氧或兼性厌氧的革兰阳性菌[1]，能适应各种极端环境，即使在长时间的干旱、pH值4.7～9.6、温度0～45℃条件下也能生存与繁殖[2]。此外，它还能耐受高浓度的盐，即便在10%～20%的盐浓度下依然可以生存，因此在环境中广泛存在[3]。李斯特菌寄生于土壤和无症状动物的肠道内，土壤和粪便的污染导致细菌易于出现在饲料中，尤其是青贮饲料，因此牛、羊等反刍动物具有较高的患病率[2]。此外，李斯特菌也是人类李斯特菌病的病原体，人类食用受污染的食物而发生感染[4-5]。李斯特菌的感染具有趋向性，它常以中枢神经系统和胎盘系统为靶器官，侵入神经系统时，在人类主要表现为脑膜炎和脑膜脑炎，在反刍动物主要表现为菱形脑炎[5-6]；当其侵入胎盘系统时，则会引起围产期胎儿流产、死产或胎儿的全身性感染[7]。此外，李斯特菌还可能引起菌血症、败血症以及发热性胃肠炎等病症[8]。李斯特菌对畜牧业和公共卫生影响巨大，已成为影响全球公共卫生安全的一个重要问题[2,9]。李斯特菌菌体蛋白抗体是由标准李斯特菌1株和4a株中分离得到的抗原所制备得来，此抗体免疫原是李斯特菌全细胞蛋白[10]。通过李斯特菌菌体蛋白的免疫组织化学试验结果即可得知李斯特菌侵入中枢神经系统后的分布情况。

脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是中枢神经系统内一种重要的神经营养素[11]，它能够促进神经元的存活、生长、迁移和分化成熟，维持神经元的正常功能，保护神经元免受损伤[11-12]。有学者发现运动可以防止视网膜损伤后BDNF水平的下降，从而通过阻止补体介导的突触消除来保护神经元，并维持其功能[13]，而BDNF-TrkB通路可介导内源性气体介质硫化氢对甲醛诱导的PC12细胞毒性、氧化应激和凋亡的神经保护[14]。国内外对李斯特菌及BDNF的研究已较为深入，但对于李斯特菌侵入山羊中枢神经系统的定位以及侵入后对中枢神经系统中BDNF表达的影响研究还未见报道，本研究通过对这两方面的探讨，以期对李斯特菌的进一步深入研究及临床更好地防治提供一定的理论基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料赣西某山羊养殖场已确诊感染李斯特菌发病山羊3头(感染组)以及3头未感染李斯特菌的正常山羊(对照组)，分别采集其大脑、中脑、小脑、脑桥和脊髓，用PBS洗后部分放入4%多聚甲醛固定，用于姬姆萨染色和免疫组织化学试验，部分迅速放入液氮，后转移至-80℃冰箱保存，用于蛋白质印迹试验。

1.2 主要试剂李斯特菌菌体蛋白抗体(bs-4581R)购自Bioss公司，BDNF抗体(SC-546)购自Santa Cruz公司，兔SP试剂盒、DAB显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，二抗Goat Anti-Rabbit IgG(ab6721)购自Abcam公司，Mouse Anti-β-actin内参蛋白(BM0627)和Western blot彩色预染蛋白Marker(AR1113)购自博士德生物公司，4×Protein Loading Buffer(AI11800A)购自TaKaRa公司，超敏化学发光检测试剂盒(GS0720)购自US EVERBRIGHT INC公司，姬姆色素(51811-82-6)购自北京梦怡美生物科技有限公司。

1.3 姬姆萨染色将石蜡切片常规脱蜡水化，蒸馏水洗2次，1 min/次。置于含姬姆萨工作液的染缸中染色18 h，蒸馏水微洗后以0.5%乙酸洗1 min，自来水稍微冲洗。用无水乙醇迅速脱水3次，5 s/次。二甲苯透明，封片后观察拍照。

1.4 免疫组织化学将石蜡切片置于烘片机上烘干，后脱蜡水化，置于蒸馏水和PBS中各浸泡5 min，随即进行抗原修复10 min，冷却至室温后用PBS洗涤3次，每次3 min，随后按兔SP试剂盒说明书进行阻断和封闭。PBS洗涤后37℃孵育一抗(李斯特菌菌体蛋白抗体和BDNF抗体均按1∶400进行稀释，阴性对照以PBS替代)1 h，继续按兔SP试剂盒说明书进行操作。然后进行DAB显色，苏木精复染，盐酸酒精分化，返蓝后脱水透明，封片后立即进行观察和拍照。DAB显色部位呈黄色者为阳性，呈浅黄色者为弱阳性，否则为阴性。

1.5 蛋白质印迹技术取各脑组织研磨碾碎，加入裂解液裂解后用总蛋白提取试剂盒抽提制备蛋白提取液。采用BCA法测定蛋白浓度，并使感染组和正常组的总蛋白浓度保持一致。制备好分离胶和浓缩胶，并按比例在蛋白提取液中加入4×Protein Loading Buffer制成蛋白上样液，按顺序上样后进行SDS-PAGE 凝胶电泳2.0 h，取凝胶孵PVDF膜湿转1.5 h，TBST洗涤后封闭2.0 h，将膜裁剪成适当大小后用TBST洗涤3次，10 min/次，4℃条件下放入一抗(BDNF按1∶500进行稀释)与内参蛋白Mouse Anti-β-actin(1∶1 000稀释)孵育18 h，TBST洗涤3次，10 min/次，孵育二抗Goat Anti-Rabbit IgG(按1∶10 000进行稀释)，内参蛋白(按1∶10 000进行稀释)2 h，TBST洗涤3次，10 min/次。最后将PVDF膜按照HRP-ECL化学发光试剂盒的说明进行成像，运用AI600化学发光成像仪拍照。

1.6 图像与数据分析运用Image Pro Plus 6.0软件对采集的图片进行分析，将目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值作为测试值，并用SPSS 18.0软件进行独立样本t检验。当P<0.01时表示差异极显著，P<0.05时表示差异显著，P>0.05时表示差异不显著。

2 结果

2.1 李斯特菌在中枢神经系统的定位在感染组山羊中枢神经系统中，李斯特菌主要分布于大脑锥体层锥体细胞、多形细胞层梭形细胞及内、外颗粒层(图1A)、小脑颗粒层颗粒细胞(图1B)、中脑灰质部胶质细胞、中性粒细胞和淋巴细胞及其周边组织(图1 C)、脑桥灰质部中间神经元和中性粒细胞等(图1 D)，以及脊髓中央管室管膜上皮细胞(图1E)。对照组则无李斯特菌分布(图1F)。

A～E.分别为李斯特菌在感染组山羊大脑、小脑、中脑、脑桥和脊髓的分布情况；F.对照组山羊大脑姬姆萨染色情况；箭头所指均为李斯特菌

2.2 李斯特菌菌体蛋白在中枢神经系统的表达定位在感染李斯特菌山羊中枢神经系统中，大脑、小脑、中脑及脑桥菌体蛋白表达较多，且主要在胞质表达。其中大脑在内锥体层的大、中型锥体细胞及多形细胞层的梭形细胞呈阳性表达，在外颗粒层及内颗粒层呈弱阳性表达(图2A)。小脑主要在颗粒层细胞外表达，浦肯野细胞层也有所表达，但表达很弱(图2B)。中脑主要在灰质部的胶质细胞及白质部的中间神经元以及中性粒细胞和淋巴细胞表达(图2C)。脑桥主要在中间神经元、中性粒细胞和巨噬细胞的胞质中表达，在轴突及神经纤维网也有所表达(图2D)。脊髓除脊髓中央管的室管膜细胞呈阳性表达外，其余部位均无表达(图2E)。对照组山羊各脑组织中均未见李斯特菌菌体蛋白表达(图2a～e)。

2.3 BDNF在中枢神经系统的表达定位BDNF在感染李斯特菌山羊大脑、小脑及中脑呈阳性表达，主要在胞质中表达。其中大脑主要在外锥体层中、小型锥体细胞及星形细胞表达，内颗粒层星形细胞，内锥体层大、中型锥体细胞，多形细胞层的梭形细胞、小型锥形细胞，分子层及外颗粒层呈弱阳性表达或无表达(图3A)。小脑主要在皮质部表达，髓质不表达，皮质中以颗粒层表达更强，浦肯野细胞层及分子层次之(图3B)。中脑主要在胶质细胞、中间神经元和淋巴细胞表达(图3C)。脑桥也有阳性反应，主要表达在中性粒细胞、胶质细胞、巨噬细胞及淋巴细胞，但相比小脑和中脑等表达更弱(图3D)，脊髓则无表达(图3E)。BDNF在对照组山羊大脑内锥体层表达相对较强，但相比感染组表达很弱，外颗粒层及外锥体层呈弱阳性表达(图3a)。在中脑中也呈弱阳性表达，但表达的细胞数量比感染组更少(图3c)。BDNF在对照组小脑(图3b)、脑桥(图3d)和脊髓(图3e)中未见表达。

A～E.分别为感染组山羊大脑、小脑、中脑、脑桥和脊髓BDNF的表达情况；a～e.分别为对照组山羊大脑、小脑、中脑、脑桥和脊髓BDNF的表达情况。图A、a为大脑多形细胞层，箭头所指为梭形细胞；图B箭头所指为颗粒层颗粒细胞间阳性区域；图C、c箭头所指为胶质细胞；图D箭头所指为中性粒细胞；箭头所指均为阳性表达区域

2.4 BDNF在中枢神经系统的定量表达情况如图4所示，与对照组相比，感染组山羊大脑和脑桥BDNF表达量极显著升高(P<0.01)，小脑、中脑和脊髓BDNF表达量显著升高(P<0.05)。

A.BDNF蛋白在大脑、小脑、中脑、脑桥和脊髓的Western blot检测结果；B为使用Image J软件时图A的Western blot定量结果进行分析。同一组织2个组间标记不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)

3 讨论

李斯特菌是一种食源性细菌，畜禽食用受污染的饲料而患李斯特菌病，其典型侵入途径是胃肠道。作为一种胞内寄生菌，李斯特菌进入肠腔后，不会直接破坏肠壁的完整性，而是先进入肠上皮细胞，借此逃避局部免疫，进而通过门脉系统进入肝脏和脾脏的网状内皮细胞，当其被释放出来后，即可能引起菌血症[1]。李斯特菌通过血行途径到达中枢，破坏血脑屏障，侵入各脑组织，从而引起单侧眼失明和转圈等神经症状[6,15-16]。本试验姬姆萨染色及李斯特菌菌体蛋白免疫组织化学结果显示，李斯特菌主要侵入部位为山羊大脑、小脑、中脑及脑桥，而在脊髓中仅脊髓中央管室管膜上皮细胞有所分布，这与其他学者免疫组织化学菌体蛋白定位研究结果相似，包括在小脑颗粒层细胞外的表达，中脑和脑桥中性粒细胞、巨噬细胞以及脑桥轴突、神经纤维网的表达，并发现脑组织病变始终可见于中脑吻侧，包括间脑和端脑，且从低位脑干到大脑、小脑以及脊髓的尾侧，其严重程度逐渐降低[17]，这也提示李斯特菌可能通过口腔和肠道的黏膜或通过受感染的巨噬细胞的细胞间传播侵入颅神经或神经末梢，并通过轴突迁移到脑干进一步扩散到大脑其他区域[17-18]。另有研究表明所有患有李斯特菌脑炎的动物脑干区均受损伤，且大部分急性和亚急性菱形脑炎可在三叉神经节和颅神经中检测到李斯特菌，并发现李斯特菌对神经系统的侵入主要通过轴突扩散[19]。

李斯特菌病虽然发病率低，但致死率高，可达20%～30%，目前虽有较好的治疗方法，但仍需重视，控制发病率[8]。本试验研究发现BDNF可能对李斯特菌的侵入有一定的防御抵抗作用。BDNF是神经营养因子家族的一员，而神经营养因子是一类独特的多肽生长因子，它存在于所有脊椎动物中，还包括神经生长因子(NGF)、神经营养因子3(NT-3)和神经营养因子4(NT-4)，这些因子被认为是神经系统发育过程中起关键作用的信号分子，能够影响神经元的增殖、分化和存活，对人类中枢神经系统的高级功能如学习与记忆等有巨大影响[20]。BDNF是神经营养因子家族的主要成员，在皮层、海马、边缘结构、小脑和嗅球等结构中均有高表达，其在中枢神经系统功能调节中具有重要作用，并且已经证实BDNF是突触细化、可塑性和神经保护的关键因素[13,20-22]。还有研究表明BDNF表达水平的提高可显著增加轴突分支和突触数量，并以此来影响神经回路的功能复杂性[23]。本试验免疫组织化学和蛋白质印迹结果显示在自然感染李斯特菌山羊中枢神经系统中BDNF在大脑、小脑、中脑、脑桥以及脊髓中的表达均有所增加，表明BDNF可能在李斯特菌感染神经系统后发挥一定的保护作用。关于BDNF对神经系统的维持和保护作用已有不少研究，BDNF能够促进大脑基底神经节纹状体神经元的存活，促进其成熟，维持细胞正常功能，从而成为亨廷顿舞蹈症的潜在治疗靶点[24-25]；BDNF还能促进小脑颗粒细胞的存活，促进其迁移，刺激轴突的生长[26]。此外，神经胶质细胞可在孕酮作用下释放成熟BDNF，促进神经元的突触形成和存活[27]。在本研究中各脑组织则可能通过增加BDNF的表达来抵抗李斯特菌的侵入及修复其所带来的损伤，但其具体保护机制有待进一步研究。