蝉花多糖对肉鸡生长性能、抗氧化能力和肠道菌群的影响

李瑞萍，刘长国，张 硕，董丽艳，王秋霞，徐时湘，李国勤，田 勇，柴一秋，刘素贞*，卢立志*

(1．浙江农林大学 动物科技学院，浙江 杭州 311300；2.温州科技职业学院 动物科学学院，浙江 温州 325000；3.浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，浙江 杭州 310021；4.浙江省亚热带作物研究所 温州市虫生真菌资源研究与开发重点实验室，浙江 温州 325005)

随着消费者越来越关注肉品质的健康与安全[1-2]，同时我国减抗、禁抗政策逐渐完善，寻找新型绿色饲料添加剂成为研究热点。蝉花多糖属于我国传统型中药的提取物，多糖能通过调节肠道菌群和影响机体免疫系统达到加强机体健康水平的目的[3-4]。蝉花多糖起到抗氧化[5]、抑菌作用[6]、提高肉鸡体质量、饲料利用率[7]等作用。目前，蝉花多糖在小鼠上的研究更为集中，蝉花多糖用于鸡的应用研究鲜有报道，本课题组前期研究了蝉花多糖对肉鸡免疫、生长发育的影响[7-8]。本试验在前期研究的基础上，将更全面的探讨鸡养殖中蝉花多糖在提高鸡的生长性能、增强抗氧化水平和保护肠道菌群方面的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料蝉花多糖由浙江省亚热带作物研究所自蝉花虫草子实体经过多层工艺制得[9];杆菌肽锌(批号：P181013)，由绿康生化有限公司提供;鸡新城疫活疫苗LaSota株，由博美莱生物制品有限公司提供。

1.2 试验设计将270只1日龄雁荡麻鸡[10](浙江绿雁有限公司提供)随机分为6组，分别用A、B、C、D、E、F表示，每组3个重复，每个重复15只，公母各半。在11～17日龄和25～31日龄，按照表1方案进行灌服，1次/d。其中B～F组(免疫) 在14，28日龄用新城疫弱毒疫苗点眼免疫，A组(非免疫)用等量生理盐水点眼。

表1 雁荡麻鸡灌服添加剂成分及剂量

1.3 饲养管理试验于2019年5月在温州种子种苗科技园进行，试验期从1日龄开始，42日龄结束。试验鸡采用双层立体笼养，自由采食(无抗基础日粮由温州正泰农牧有限公司提供，日粮组成及营养成分见表2)、饮水，采用自然光照和通风。每日准时打扫卫生，观察试验鸡精神和健康状况。

表2 无抗基础饲粮组成及营养水平 %

1.4 测定指标及方法

1.4.1生长性能测定 每天记录投料量、剩余料量和采食量，分别于8，28，42日龄早9:00测量每个重复试验鸡空腹时的体质量，并计算平均日增体质量(ADG)、料重比(F/G)。

1.4.2血清生化指标测定 于试验鸡42日龄，分别从每个重复中任选6只鸡，进行静脉采血，分离血清并在-20℃保存。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)采用北京华英生物技术研究所的比色试剂盒，A6半自动生化仪(北京松上技术有限公司)测定。

1.4.3粪便菌群结构分析 在试验鸡42日龄，随机选取B、C、E、F组每个重复2只，每组共6只(其中E组5只)，处死后取盲肠内容物至无菌冻存管，迅速放入液氮，后转移至-80℃保存。使用power soil DNA isolation Kit试剂盒(MOBIO Laboratories)从鸡的盲肠内容物中提取总细菌DNA。通过D260/D280的比值评估DNA质量和数量,1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测纯度，然后将DNA暂存在-80℃待处理。用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增细菌 16S rRNA 基因的 V3～V4 区域。PCR 扩增体系(50 μL)包含10 μL Buffer，10 μL高GC增强剂，1 μL dNTP，0.2 μL Q5高保真DNA聚合酶，10 μmol/L 引物及60 ng基因组DNA。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃ 1 min，15个循环；72℃延伸7 min。第一步PCR产物通过VAHTSTM DNA Clean Beads纯化。第2步PCR在40 μL反应体系中进行，包含20 μL 2×Phusion HF MM，8 μL ddH2O，第一步10 μL PCR的产物和10 μmol/L每种引物。反应条件如下：初始变性在98℃ 30 s，98℃ 10 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，10个循环;72℃延伸5 min。最后通过Quant-iTTMdsDNA HS试剂定量所有PCR产物并把其合并在一起;由中国北京百迈客生物科技有限公司使用Illumina Hiseq 2500平台(PE250)对纯化的混合样品进行细菌rRNA基因的高通量测序分析。

4.2 植株调整：当植株高30厘米或出现卷须时要及时搭架引蔓，引蔓最好在下午进行，以免损伤茎蔓。引蔓和绑蔓使其茎叶分布均匀，苦瓜有很强的分枝能力，若任其生长，则会造成枝叶过分茂密，消耗养分，且植株间透气性差，易发生病虫害，也会影响主蔓的正常生长和开花结果，因此，在上架同时，将棚架以下的侧枝全部摘除，保证培育健壮的主蔓，在主蔓上架以后，适当选留中上部强壮的侧蔓，以提高产量。在旺盛生长期，枝叶繁茂，要及时摘除植株下部的黄叶和病叶，保证通风透光，延长采收时间，提高产量和质量。

粪便菌群结构分析使用USEARCH软件[11]对Tags在97%的相似度水平下进行聚类获得OTU，并基于Silva(细菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释。使用QIIME软件进行 Beta 多样性(Beta diversity)分析，比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度。基于Beta多样性分析得到的4种距离矩阵，使用R语言工具分别绘制PCoA分析。

2 结果

2.1 蝉花多糖对雁荡麻鸡生长性能的影响由表3可知，28日龄时， E组体质量显著高于A～C组(P<0.05)，F组体质量高于B、C组，C组体质量低于A组，但差异不显著(P>0.05)；42日龄时，E、F组体质量高于A、B组，且A、B组体质量高于C组，其中E组体质量显著高于B、C组(P>0.05)。

表3 各组雁荡麻鸡体质量测定表 g

由表4可知，整个试验期E组ADG和F/G均优于A、C组。其中8～28日龄，E组ADG、F/G优于A～C组，且ADG显著优于B、C组(P<0.05)，F/G显著低于A～C组(P<0.05)，A组ADG、F/G优于B、C组(P>0.05)；29～42日龄，D～F组ADG高于A、C组，且E、F组显著高于C组(P<0.05)，D、F组F/G低于A～C组，且D组显著低于C组(P<0.05)，E组F/G低于B、C组(P>0.05)，A、B组ADG、F/G优于C组，且B组ADG显著高于C组(P>0.05)；D～F组全期ADG高于B、C组，其中E组全期ADG高于其余各组且显著高于B组(P<0.05)，同时，A组全期ADG高于B、C组，但差异不显著(P>0.05)；D～F组全期F/G低于A～C组，且D、F组显著低于C组(P<0.05)，A、B组全期F/G低于C组，但差异不显著(P>0.05)。

表4 蝉花多糖对雁荡麻鸡生长性能的影响

2.2 蝉花多糖对雁荡麻鸡血清抗氧化水平的影响由表5可知，D～F组血清中T-AOC、SOD、GSH-PX含量高于A～C组，其中D、E组T-AOC、SOD含量显著高于A、C组(P<0.05)，GSH-Px含量显著高于A～C组(P<0.05)，F组T-AOC含量显著高于A～C组，SOD含量显著高于C组，GSH-Px含量显著高于A、B组(P<0.05)，同时，A、B组T-AOC、SOD含量显著高于C组(P<0.05)；E、F组血清中CAT含量高于A～C组，但无显著性差异(P>0.05)。

表5 蝉花多糖对雁荡麻鸡血清抗氧化水平的影响 U/mL

2.3 蝉花多糖对雁荡麻鸡肠道菌群的影响

2.3.1蝉花多糖对雁荡麻鸡肠道微生物的影响 23个样品测序共获得1 805 666对Reads，双端Reads拼接、过滤后共产生1 628 985条Clean tags，每个样品至少产生47 746条Clean tags，平均产生70 825条Clean tags。如图1所示，每组样品稀释曲线趋于平缓，表明实际测序深度基本覆盖微生物群落多样性[12]。

图1 样本稀释曲线

2.3.2蝉花多糖对雁荡麻鸡肠道微生物α多样性的影响 由表6可知，E、F组较B、C组物种数量有所增加，且显著高于C组(P<0.05)，同时B组物种数量也多于C组，但无显著性差异(P>0.05)；F组中物种多样性显著高于B、C组(P<0.05)，E组中物种多样性显著高于B组(P<0.05)，B与C组之间的物种多样性无显著性差异(P>0.05)。

表6 雁荡麻鸡肠道微生物α多样性

图2 β多样性

2.3.4蝉花多糖对雁荡麻鸡肠道微生物门水平和属水平的影响 在门水平上和属水平上分别以微生物丰度TOP10的菌属作为各组的优势菌群进行分析。如图3所示，在门水平上，雁荡麻鸡肠道内微生物没有显著性差异(图3A)，但在属水平上(图3B)，与B、C组相比，E组拟杆菌属(Bacteroides)分别增加了26.27%,26.22%，F组拟杆菌属分别增加34.92%,34.88%，E组粪杆菌属(Faecalibacterium)比C组增加了9.24%。

图3 门水平和属水平上微生物分布柱状图

2.3.5Lefse分析 通过Lefse分析设LDA阀值为4.0，进一步比较不同组间之间具有差异的肠道菌群[13]。由图4所示，与免疫对照组和抗生素对照组相比，在E组中富集的biomaker主要有：拟杆菌属(Bacteroides)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、梭菌属(Fusobacterium)，F组富集的biomaker主要包括：巨单胞菌属(Megamonas)、Negativicutes纲、Selenomonadales目、韦荣菌科(Veillonellaceae)。

2.3.6KEGG功能预测 针对KEGG代谢途径差异的分析，比较抗生素对照组和蝉花中高剂量组(50,100 mg/kg)在微生物群落功能基因的差异，如图4所示。结果表明，E、F与C组相比差异功能通路分别为16，2个，其中E组中的辅助因子和维生素的代谢、细胞群落-原核生物、细胞活性、折叠、分类和降解、免疫系统、环境适应等通路相对丰度高于C组，F组中核苷酸代谢、消化系统通路高于C组。

c.纲；o.目；f.科；g.属；s.种

图5 抗生素对照组和蝉花中高剂量组KEGG代谢途径差异

3 讨论

3.1 蝉花多糖对雁荡麻鸡生长性能的影响体质量、ADG、F/G等指标可以直观反映畜禽生长性能[14]。KOH等[15]报道服用冬虫夏草菌丝提取物的肉仔鸡体质量较服用抗生素的肉仔鸡的体质量有显著提高。同样，蛹虫草发酵产物也能显著增加肉仔鸡的采食量和体质量[16]。本研究饲喂蝉花多糖试验鸡的体质量、ADG及F/G都得到了不同程度地优化，在28，42日龄均以添加50 mg/kg蝉花多糖试验鸡的体质量增加最为显著，并显著高于免疫对照组和抗生素对照组；表明蝉花多糖与这些虫草添加剂效果相似，对鸡的生长性能都有促进作用。

本试验结果显示，在肉鸡生长阶段中添加50 mg/kg 的蝉花多糖能更有效增加肉鸡ADG，降低F/G。申远航等[17]研究发现，在断奶仔猪生长发育中饲喂中草药在ADG方面显著优于抗生素，这与本试验结论相似，饲喂50 mg/kg的蝉花多糖的肉鸡ADG显著优于抗生素对照组。孙甜甜等[18]的研究中枸杞粗多糖显著增高了22～42日龄肉仔鸡的ADG且降低了F/G。蝉花多糖作为真菌提取物，在机体内与机体产生相互作用，由此提高鸡的体质量、增加ADG及降低F/G，其作用机制尚未有更深入的研究，但其应用效果已经得到部分证实。

3.2 蝉花多糖对雁荡麻鸡血清抗氧化水平的影响GSH-Px、SOD是机体主要的抗氧化酶，维持细胞膜的稳态，均能清除体内自由基[19-20]。T-AOC则代表了动物体的抗氧化能力[21]。植物多糖能提高GSH-Px、SOD、CAT的活性从而减少机体内过氧化产物的含量[22]。过量的活性氧在机体内产生脂质过氧化物从而危害机体健康[23]。综合本次对血清抗氧化指标的研究结果，灌喂蝉花多糖50 mg/kg的试验鸡血清中T-AOC、SOD、GSH-Px都得到了有效提高，证明蝉花多糖该剂量抗氧化水平最佳。这与丁浩轩等[24]的研究相似，杜仲提取物(多糖、黄酮类化合物等)显著提高了肉鸡血清中GSH-Px、T-AOC、SOD等水平，植物多糖添加剂不仅加强机体对活性氧自由基的清除能力，而且机体血清内抗氧化酶活性的提升有助于抑制脂质过氧化。三七多糖可以清除DPPH和ABTS自由基，在抗氧化能力方面有良好的表现[25]。说明植物中的多糖成分是非常有效的抗氧化剂来源[26]。

3.3 蝉花多糖对雁荡麻鸡盲肠菌群多样性的影响肠道菌群是机体对抗疾病的主要防御成分之一[27]。在众多对肠道菌群产生影响的因素中，饮食对机体肠道微生物菌群的多样性起到重要作用。盲肠是鸡体内微生物最密集的场所，其微生物多样性远高于上消化道[28]。Chao1、Ace指数是α多样性中常用于度量微生物丰度，Shannon数值越高，Simpson数值越低，则物种多样性越丰富[29]。本试验结果表明饲喂蝉花多糖的试验鸡肠道微生物α多样性更为丰富，同时，免疫对照组、抗生素对照组、蝉花多糖中剂量组(50 mg/kg)和蝉花多糖高剂量组(100 mg/kg)之间的β多样性也存在显著性差异。

拟杆菌属类属于拟杆菌门，粪杆菌属则类属于厚壁菌门。拟杆菌属具有降解植物多糖的能力[30]，同时会改善肠道环境使其更适合与其他肠道菌群生存[31]。肠道微生物发酵产生短链脂肪酸，包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐等，起到维持肠道稳态、调节肠道水电解质平衡等作用[32]。拟杆菌属通过在肠道中产生乙酸盐和丙酸盐，从而提高肠道代谢功能[33]。粪杆菌属是丁酸盐的生产者[34]，丁酸盐能够协调机体抵御外来病原体入侵，降低机体炎症反应，其发挥免疫调节作用的机制是通过上调抗菌肽的表达[35]。丁酸盐在维持机体氧化还原平衡中也起到了重要作用[36]，蝉花多糖中剂量组(50 mg/kg)中试验鸡肠道内的粪杆菌属高于抗生素对照组，这可能也是饲喂蝉花多糖的试验鸡在抗氧化能力中显著优于空白对照组、免疫对照组及抗生素对照组的因素之一。随着拟杆菌门和厚壁菌门比例的升高，机体脂肪代谢能力也随之发生改变，机体脂肪更容易蓄积[37]。蝉花多糖中剂量组(50 mg/kg)中拟杆菌属和粪杆菌属比例比抗生素对照组高，所以添加蝉花多糖(50 mg/kg)的试验鸡在生产性能方面表现的更为突出可能是因为该试验组中的试验鸡肠道菌群促使宿主在食物中获取更多能量。短链脂肪酸还能促进肠肽分泌，增加机体饱腹感从而减少食量[38]，这也可能是饲喂蝉花多糖的试验鸡F/G较低的原因之一。尽管如此，肉鸡肠道内的微生物群落和菌群的比例依然会随着年龄、饮食和添加剂、环境等因素不断的变换[39]。探究肠道微生物对机体生长性能、抗氧化等方面产生的影响，还需要进一步验证。

抗生素可以广泛但不可精确地调节微生物群，抗生素的摄入扰乱了肠道微生物群落的稳定，从而使得病原菌更容易侵袭机体[40]。在本试验条件下，饲料添加剂的改变虽然不会大幅度改变门水平上肠道菌群分类水平，但会影响分类级别较低的纲、目、科、属等水平的丰度。通过蝉花多糖对雁荡麻鸡中关键菌群的影响发现，关键菌群大多属于拟杆菌门(Bacteroides、Bacteroidaceae)、厚壁菌门(Fusobacterium、Negativicutes纲、Selenomonadales目、Vei-llonellaceae)。综合蝉花多糖对雁荡麻鸡生长性能、抗氧化、Lefse的分析，由此推测，增多的Bacteroides、Bacteroidaceae、Fusobacterium是造成蝉花多糖中剂量组的试验鸡在生产性能、抗氧化方面更具优势的关键菌群，而增多的Megamonas、Negativicutes纲、Selenomonadales目、Veillonellaceae可能是使蝉花多糖中剂量组(50 mg/kg)在生产性能、抗氧化方面表现优良的关键菌群。

在KEGG代谢途径功能预测中，蝉花多糖中剂量组(50 mg/kg)与抗生素对照组相比肠道微生物群落的功能基因在辅助因子和维生素的代谢、免疫系统、环境适应等代谢途径上存在显著性差异；蝉花多糖高剂量组(100 mg/kg)与抗生素对照组之间肠道微生物群落中的核苷酸代谢、消化系统的相对丰度增加。再次说明，适宜剂量的蝉花多糖能够对肠道菌群起到调节作用，且体现在微生物多样性、丰度、结构及关键菌群等多方面。由此推测蝉花多糖可能是通过上调这些通路中的基因，改善菌群的新陈代谢，提高其对环境的适应能力及调节免疫系统和消化系统，但基于通路探讨蝉花多糖的作用还需要通过代谢组学等进一步研究。

添加蝉花多糖能提高雁荡麻鸡体质量、ADG，降低F/G，并提高雁荡麻鸡血清抗氧化水平，在一定程度上能影响鸡肠道微生物菌群多样性，从而提高机体健康水平。本试验条件下，蝉花多糖中剂量组(50 mg/kg)效果最佳。