制痂酊对大鼠深Ⅱ度烧伤的创伤修复及作用机制

李飞龙，黄赵刚，程 钢,高金平，詹迪迪，李 俊，夏 泉

(1.安徽医科大学第一附属医院药剂科、国家中医药管理局中药化学三级实验室，2.安徽医科大学药学院，3.安徽医科大学第一附属医院皮肤科、安徽医科大学皮肤病研究所，安徽 合肥 230032；4.安徽省儿童医院药剂科,安徽 合肥 230051)

烧伤是常见的创伤类疾病，处于外伤疾病第四位，全球每年有大量的人因烧伤而死亡。烧烫伤具有较高的致残、致死率，危害程度高，给人类社会造成重大的负担[1-2]。制痂酊为我院特色制剂(皖药制字Z20050013)，由黄柏、黄芩、儿茶、冰片采用渗漉的方法制备而成。其主要成分为黄芩苷、儿茶素和小檗碱，具有抑菌、减少炎症反应、收敛、促进创面愈合和结痂等作用，广泛应用于烧伤、褥疮及皮肤擦伤的治疗等，临床疗效确切[3-4]。前期研究对制痂酊主要成份黄芩苷、小檗碱的含量做了严格的质量控制，保证了制剂安全有效[5]。本研究采用大鼠深Ⅱ度烧伤模型，观察制痂酊对烧伤后大鼠的创面修护作用和对血清炎症介质的影响，探讨其可能的作用机制，为制痂酊的使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 普通级SD大鼠100只，雌雄各半，体质量(200-250)g。由安徽医科大学动物中心提供，许可证号SCXK(皖)2017-001。

1.1.2药品与试剂 制痂酊(安徽医科大学第一附属医院制剂，皖药制字Z20050013：批号190619)；湿润烧伤膏(汕头市美宝制药有限公司，国药准字Z20000004)；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1B)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.1.3仪器与设备 Zokia HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器公司); AB135-5电子天平(上海梅特勒)；YXQ-LS-100II高压灭菌锅(上海博迅实业有限公司)；电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)；多功能酶标仪(美国Tecan公司)；台式控温烫伤仪(振华仪器有限公司)；SB3200超声波清洗器(必能信超声仪器公司)。

1.2 方法

1.2.1动物分组与模型制备 大鼠饲养7 d，随机分为正常组、模型组、阳性对照组(湿润烧伤膏)、制痂酊高剂量组(含黄芩苷:5.92 g·L-1、盐酸小檗碱:3.28 g·L-1、儿茶素：42.62 g·L-1)，制痂酊低剂量组(含黄芩苷:2.96 g·L-1、盐盐酸小檗碱:1.64 g·L-1、儿茶素：21.31 g·L-1)，各组20只。除正常组外，其余各组制备深Ⅱ度烧伤大鼠模型[6]：大鼠禁水禁食12 h，剃除背部毛发后，用10%的硫化钠溶液脱毛，腹腔注射10%水合氯醛溶液(3.5 mL·kg-1)麻醉，乳酸钠林格抗休克，大鼠均未出现休克。病理证实为深Ⅱ度烧伤：烧伤部位局部表皮消失，部分真皮层内细胞坏死，皮下组织血管扩张水肿，可见急慢性炎细胞浸润，为深Ⅱ度烫伤。

1.2.2创面处理及给药方法 大鼠烫伤30 min后，阳性对照组给予湿润烧伤膏、制痂酊高、低剂量组创面分别高剂量制痂酊、低剂量制痂酊，每天换药2次，每次换药前无菌生理盐水清洗，正常组与模型组只用无菌生理盐水清洗。为防止大鼠舔舐伤口，在其头颈部套一硬壳项圈。单笼饲养，自由进食饮水。

1.2.3创面愈合率 每组各取5只大鼠，计算3 d，7 d，14 d的创面愈合率。通过标记称质量法计算创面愈合率：造模2 d后作为烧伤面积，大鼠创面铺上方格透明纸，边缘处描绘作为记号，方格纸剪下称质量代替创面面积，创面愈合率/%=(烧伤面积-创面面积)/烧伤面积×100%。

1.2.4创面组织含水量测定 每组各取5只大鼠，计算3 、7、14 d的创面组织含水量。大鼠麻醉后颈椎脱臼处死，切下创面完整皮肤组织约200 mg，清净后称质量(W1)，烤箱烘干(80 ℃，24 h)称质量(W2)。利用组织烘干前后水分前后减少的方法计算组织含水量：创面含水量/%=(W1-W2)/W1×100%。

1.2.5深Ⅱ度烧伤大鼠创面组织SOD 、CAT含量和MDA活性的测定 烫伤7 d取大鼠8只，麻醉处死后，切下创面完整皮肤组织在冰上破碎，用10%的冷生理盐水研磨成浆，4 ℃离心(3 000 r·min-1，10 min)，按照试剂盒操作方法，测定各组大鼠创面组织SOD、CAT活性和MDA含量。

1.2.6深Ⅱ度烧伤大鼠血清制备及TNF-α、IL-1β、IL-6水平测定 大鼠麻醉后，股动脉取血，离心取上清(3 500 r·min-1，10 min)，ELISA法检测烫伤后 7 d各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，步骤按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理实验数据以表示，SPSS 22.0进行单因素方差分析，组间差异采用LSD法。

2 结果

2.1 制痂酊对深Ⅱ度烧伤大鼠创面愈合率的影响烧伤后d 3各组大鼠创面愈合率无差异；d 7创面愈合率明显升高，与模型组相比，阳性对照组、高剂量、低剂量制痂酊组差异均有显著性(P< 0.05)；d 14各组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，制痂酊高剂量组与阳性药组相比差异有统计学意义(P<0.05)。表明制痂酊能促进创面的愈合，愈合效果和时间剂量呈一定的关系，创面愈合效果随着用药时间延长呈上升趋势。见Tab 1。

Tab 1 Effect of Medicoscab Tincture on wound healing rate of deep partial thickness burn

2.2 制痂酊对深Ⅱ度烧伤大鼠创面含水量的影响深Ⅱ度烧伤大鼠各组创面含水量比正常组明显升高(P<0.05)。阳性对照组、制痂酊高低剂量组，创面含水量d 1就有所降低，随着用药持续，含水量在烫伤各时间点逐渐下降，但仍高于正常组。阳性对照组，制痂酊高、低剂量组创面含水量在d 7、14显著下降，与模型组相比差异有显著性(P<0.05)。制痂酊高、低剂量与阳性对照组无差异(P>0.05)，见Tab 2。

Tab 2 Effect of Medicoscab Tincture on wound water content of deep partial thickness burn

2.3 制痂酊对深Ⅱ度烧伤大鼠对创面组织SOD、CAT含量和MDA活性的影响深Ⅱ度烧伤大鼠7 d，与正常组相比，各组大鼠创面组织SOD、CAT活性明显降低，MDA含量升高(P<0.01)；与模型组相比，阳性对照组，制痂酊高、低剂量组SOD明显升高、MDA下降(P<0.01)，CAT差异无显著性(P>0.05)。说明制痂酊能显著升高烧伤大鼠SOD的活性而下调MDA的含量，见Fig 1。

Fig 1 Effect of Medicoscab Tincture on wound SOD, CAT, MDA of deep partial thickness burn rats

2.4 制痂酊对深Ⅱ度烧伤大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响深Ⅱ度烧伤大鼠7 d，模型组

血清TNF-α、IL-1β、IL-6较正常组升高(P<0.01)。制痂酊高、低剂量组，阳性对照组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6明显低于模型组(P<0.01),见Fig 2。

Fig 2 Effect of Medicoscab Tincture on serum TNA-α, IL-1β, IL-6 of deep partial-thickness burn

3 讨论

制痂酊是由黄柏、黄芩、儿茶、冰片组成的特色中药复方制剂，临床主要用于烫伤(Ⅱ度烧伤及以下)、外伤，具有收敛消炎、抗菌、结痂等作用。烧伤创面处理非常重要，烧伤患者的生存质量与创面治疗的效果密切相关[7]。若创面处理不当，会增加治疗难度，引起创面加深甚至感染影响预后。制痂酊主要成分黄柏、黄芩具有清热解毒、泻火燥湿；儿茶能协助在创面形成一层膜，有收敛和防治细菌的感染的作用；冰片清凉开窍，以乙醇为溶媒可增强穿透力和杀菌作用。本研究显示制痂酊能在一定程度促进烧伤大鼠皮肤的愈合，缩短烧伤创面的愈合时间，对烧伤创面起到一定的保护作用。

皮肤烧伤后，烧伤组织会因炎症反应产生大量的炎性渗出。渗出液能够一定程度的稀释毒素和致炎因子，减轻毒素对局部损害，其所含补体和抗体可消灭病原体或灭活毒素。但渗出物主要成分是水，组织含水过多会引起组织水肿而缺血缺氧，造成进一步损伤，创面难以恢复。因此含水量能间接反映创面的恢复情况。本研究显示，制痂酊能减少烫伤后7 d、14 d大鼠创面组织中含水量，减少水肿，改善烧伤创面，防止进一步恶化。

皮肤烧伤后由于组织水肿而处于缺氧状态，能量代谢发生障碍，细胞产生氧化应激产生大量的氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。ROS可引起过氧化反应，损害细胞膜的结构和功能，也可以破坏血管引起渗出增加，进一步加重损伤。细胞损伤也会促进多种炎症因子如TNF-α、IL-1等释放，加重炎症损伤延缓创伤愈合[8]。天然活性的抗氧化肽AOP1可减轻烫伤引起的氧化应激，促进小鼠皮肤烫伤创面的愈合修复[9]；通过药物抑制氧化应激反应能够降低烧伤大鼠心肌、肺、肾脏组织并发症损伤[10]。SOD是生物体内一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成O2-和H2O2，在机体参与抗氧化、清除氧自由基中发挥重要作用。在过氧化氢酶(CAT)作用下H2O2分解为分子氧和水，SOD和CAT可以减少氧化应激，增强，烧伤大鼠创面的抗氧化能力，加快烧伤创面的恢复。膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)会破坏蛋白质和核酸等大分子，加剧膜的损伤。所以测量组织中SOD、CAT及MDA能够反映脂质过氧化，间接反映细胞损伤程度。实验发现，制痂酊能明显升高烧伤大鼠创面组织SOD的活性，下调MDA的含量，制痂酊促进烧伤创面愈合可能与此机制有关。

皮肤烧伤后，体内环境会发生一系列调控，表现为多种细胞炎症介质和生长因子之间相互协作。炎症反应与创面的修复有着密切的关系，炎症程度的大小能够反应烧伤创面的修复情况，过度炎症反应不利于烧伤创面的修复，甚至引起坏死[11]。炎症反应关键分子TNF-α、IL-1β，IL-6在炎症反应过程中起着重要作用。TNF-α可活化各种免疫细胞如中细粒细胞引起级联反应，诱导其他炎性细胞因子如IL-1β、IL-6等的产生，以致发生全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[12]。因此，尽早减少烧伤早期创面炎症因子的释放，可以促进烧伤的创面愈合、减少全身反应。本研究结果显示，在烧伤7 d后制痂酊能明显降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，从而减轻炎症反应，有利于创面愈合。

综上所述，制痂酊可以提高大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合率，降低创面组织含水量，其可能与制痂酊能升高烧伤大鼠创面组织SOD的活性，下调MDA的含量，降低烫伤大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量有关。关于制痂酊治疗烧伤具体分子机制和信号通路还需进一步研究。