新型TSPO配体YL-IPA08抗创伤后应激障碍的大鼠血浆代谢谱的代谢组学研究

高 尤，姬海南，相亚楠，李 聪，张文鹏，张黎明，庄笑梅

(1. 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，2. 中国检验检疫科学研究院，北京 100850)

创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD)是指个体在遇到不寻常的威胁或灾难后出现的长期精神障碍。目前，获美国FDA批准用于治疗PTSD的药物仅有五羟色胺重摄取类抑制剂(SSRIs)类别中的舍曲林和帕罗西汀。但是这些药物具有效率低、起效迟缓和严重不良反应等问题，其临床应用受到限制。目前中国无抗PTSD药物上市[1]，因此研发抗PTSD新药具有重要意义。

近几年来，哺乳动物的18 KD转位蛋白(18 KD translocator protein，TSPO)作为抗抑郁、抗焦虑、抗PTSD新型靶标备受关注。TSPO能够介导胆固醇进入线粒体内，是脑合成神经类固醇并发挥神经保护作用的关键蛋白[2]。YL-IPA08是结构全新且具有自主知识产权作用于TSPO的药物，具有明确的抗PTSD作用(已获得中国专利)，且无苯二氮卓类(BDZs)不良反应[3]。

研究表明脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)分泌减少和活性降低增加机体对PTSD的敏感性[4]。海马法尼醇受体(FXR)过表达降低BDNF的表达并引起大鼠明显的抑郁样行为，而胆汁酸激活FXR表达。因此，胆汁酸的稳态失衡是否与PTSD存在关联值得关注[5]。代谢组学通过对体内代谢物的定性定量分析，能够揭示机体在正常生命状态和内外环境变化后代谢的变化规律[6]。本研究采用代谢组学技术，寻找与PTSD相关的生物标志物及可能受影响的代谢通路，并进一步在药效明确的基础上分析YL-IPA08对PTSD大鼠内源代谢紊乱的调节作用，阐明YL-IPA08治疗PTSD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和仪器设备YL-IPA08(纯度≥99%，2019112203)由军事医学研究院合成，脱氧甘胆酸(GDCA)(BCBN5741V)、去氧胆酸(DCA)(074K0062)和熊去氧胆酸(UDCA)(074K080)购自美国Sigma公司，牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)(S380652)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)(S386503)、牛磺去氧胆酸(TDCA)(S798604)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)(S579402)、石胆酸(LCA)(S400301)、甘氨胆酸(GCA)(S495804)、甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)(S614605)和鹅去氧胆酸(CDCA)(S184301)购自Selleckchem公司，脱氢胆酸(DHLCA)(114k5322)、牛磺猪去氧胆酸(THDCA)(SLBH 1208)、甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)(SLBH2506)、甘氨石胆酸(GLCA)(1-TMH-13-4)和牛磺胆酸盐水合物(TCA)(WA12504)购自美国Fluka公司，胆酸(CA)(SLBH1420V)和猪去氧胆酸(HDCA)(SLBH1120)购自中国药品生物制品检定所。电子天平购于北京赛多利斯仪器系统有限公司，KQ-250 超声波清洗器购于昆山市超声仪器有限公司，离心机和Q Exactive Focus购于美国Thermo scientific公司，-80 ℃冰箱购于美国Thermo Fisher公司，冻干机购于美国LABCONCO公司、LCMS-8060购于日本SHIMADZU公司。

1.2 动物SD大鼠，♂，SPF级，体质量(200-220) g，购自北京斯贝福实验动物科技有限公司，许可证：SCXK(京)2011-0004。大鼠饲养于SPF级动物房中，适应性饲养7 d后按体质量随机分为对照组、模型组和治疗组，每组10只。

1.3 YL-IPA08抗PTSD的行为学研究大鼠首先适应环境7 d，每天抓取3 min，以减少无关应激刺激对后续实验操作的影响。实验过程中，保证实验环境的相对安静。之后参照文献[7]，构建经典的PTSD行为模型-单程长时应激模型(SPS)，并在此模型上用高架十字迷宫实验和开场实验评价YL-IPA08抗PTSD的行为学效应。

1.4 非靶向代谢组学血浆样品的检测方法[8]色谱条件 Dionex Ultimate 3000 超高效液相色谱仪，色谱柱：Thermo Syncronis C18 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；液相条件：A：水，B：乙腈；梯度洗脱：0-1 min，95% A；1-5 min，95%-40% A；5-8 min，40%-0 A；8-11 min，0 A；11-14 min，0-40% A；11-15 min，40%-95% A；15-18 min，95% A。流速为0.3 mL·min-1。

质谱条件 Q Exactive高分辨质谱，喷雾离子源(ESI)，采用正负离子同时扫描模式；一级全扫描(Full scan)：分辨率：70 000；扫描范围：70-1 050 m/z；二级数据依赖性扫描(Full MS/dd-MS)：分辨率：17 500。

1.5 大鼠血浆胆汁酸含量的检测大鼠血浆25 μL加入1 000 μL甲醇，振荡1 min，5×g离心10 min，小心吸取900 μL上清，挥干后，加入100 μL 50%甲醇复溶[9]，离心，取上清进样检测。色谱条件：A：水，B：甲醇：乙腈(1 ∶1)；梯度洗脱程序：2.00 min，40% B；2.50 min，45% B；3.50 min，50% B；4.60 min，55% B ；5.70 min，55% B；5.80 min，70% B；7.50 min，70% B；7.51 min，95% B；8.50 min，95% B；8.51 min，35% B；11.00 min。流速为0.5 mL·min-1。色谱柱：Shimadzu Shim-pack Velox SP-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)柱。电喷雾离子源(ESI)负离子SIM模式下采集数据。检测m/z LCA：376.10、DCA：392.20、CDCA：392.20、UDCA：392.20、HDCA：392.30、CA：408.28、GLCA：433.30、GDCA：449.20、GCDCA：449.20、GUDCA：449.20、GHDCA：449.20、GCA：465.30、TDCA：499.20、TCDCA：499.30、TUDCA：499.30、THDCA：499.20、TCA：515.20、DHLCA：374.30。

2 结果

2.1 YL-IPA08抗PTSD的行为学研究与对照组相比，SPS后大鼠的僵住时间显著延长(Tab 1)；在高架十字迷宫实验中，SPS大鼠的开臂停留百分比与开臂停留次数明显降低(Tab 2)，提示PTSD模型制备成功。慢性给予YL-IPA08后可逆转上述行为学变化，表明YL-IPA08具有明显的抗PTSD作用。同时，各组之间的开场活动差异无显著性(Tab 3)。

Tab 1 Effect of YL-IPA08 on freezing time of

Tab 2 Effect of YL-IPA08 on elevated plus-maze behavior of

Tab 3 Effect of YL-IPA08 on open field of

2.2 大鼠血浆样本总离子图采用mzcloud对大鼠血浆内源性代谢物质进行鉴定，在Trace Finder软件进行自建内源性物质[10]，血浆内源性代谢物总离子图见Fig 1，胆汁酸对照品和模型组中胆汁酸色谱图见Fig 2。

Fig 1 Plasma total ion maps in rat plasma detected by full scan

Fig 2 Bile acids chromatogram maps of reference substance and model group in rat plasma

2.3 PCA和聚类分析用于各组血浆UPLC-MS数据的模式识别采用PCA对对照组、模型组和治疗组进行分析，分析结果见Fig 3，由Scores图可以看出，各组样本均有集聚成群的趋势，说明建模后体内代谢物发生了明显的改变，给与YL-IPA08后大鼠体内代谢物状态较模型组也发生了改变。

Fig 3 Plasma PCA scores of rats in treatment group, model group and control group

2.4 PTSD模型大鼠对血浆内源性物质代谢变化的影响采用PLS-DA分析方法对对照组、模型组和治疗组血浆代谢组学数据进行分析，结果见Fig 4。通过PLS-DA方法对各组代谢物的差异进行分析，结果显示各组样本点相分离，且各样本点在一定范围内聚集较好，说明建模后，从内源代谢物的变化层面证明该模型建立成功。模型的Q2为0.71(R2X=0.927，R2Y=0.965)，即其中92.7%的变量被用来建立模型的主要成分，71%的样本符合模型判别，模型的预测能力为96.5%。PLS-DA分析后，结合P<0.05及VIP>1的条件筛选出潜在的生物标志物。与文献比较后，在大鼠血浆中鉴定出40个潜在的生物标志物信息见Tab 4，下一步将采用对照品对内源性成分逐一确认。与对照组相比，模型组大鼠的L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸、胆酸、谷氨酸含量升高，L-亮氨酸、肌酸含量降低；而治疗组大鼠的L-脯氨酸、L-缬氨酸、谷氨酸含量升高，L-精氨酸、L-亮氨酸、胆酸、肌酸含量降低(Tab 5)。

Fig 4 PLS-DA models metabolomic data of plasma samples

对大鼠血浆中差异代谢物进行相关性分析和分层聚类分析，发现差异性内源性代谢物之间呈正相关性。对照组与其他各组明显分开，并且治疗组与对照组最接近，说明治疗组对模型大鼠内源代谢紊乱具有调节作用(Fig 5)。

应用靶向代谢组学方法，对各组的胆汁酸浓度进行定量测定，经T检验分析，与对照组相比，模型组大鼠血浆中LCA、DCA、CDCA、UDCA、HDCA、CA、GCDCA、GCA、DHLCA、GUDCA、GDCA的含量呈上升趋势，TDCA、THDCA、TCA的含量呈下降趋势，治疗组大鼠血浆中LCA、DCA、CDCA、UDCA、HDCA、CA、GDCA、GUDCA、GCA、TDCA、THDCA、TCA、DHLCA的含量无明显变化。与模型组相比，治疗组大鼠血浆中DCA、CDCA、UDCA、HDCA、CA、GCA、DHLCA、LCA的含量呈下降趋势，TDCA、TCA的含量呈上升趋势。提示PTSD模型大鼠血浆中胆汁酸的含量异常，给予YL-IPA08后，大鼠血浆中胆汁酸含量有明显的回调。各组血浆样品的胆汁酸浓度及统计学分析结果见Tab 6。

Tab 4 Differential metabolic substance spectrum information

2.5 YL-IPA08对PTSD模型潜在生物标志物代谢通路的调节利用Metabo Analyst网站对PTSD模型大鼠内源代谢物进行代谢通路的富集分析，选择KEGG作为数据库，代谢通路影响值的临界设置为0.10，高于0.10是潜在的靶标路径，共得到5条PTSD模型相关的潜在代谢靶标路径(Fig 6，Tab 7)。以上结果提示，PTSD模型大鼠体内上述代谢通路可能受到了干扰。结合内源代谢物的变化(Tab 5)提示，YL-IPA08可能通过调节上述代谢通路改善大鼠PTSD样作用。

Tab 6 Influence of YL-IPA08 on plasma bile acid concentration of

Tab 7 Results from pathway analysis with MetPA (Impact>0.10)

Fig 5 (A) Relevant results of biomarker analysis, (B) Heatmap analysis of results of each group of related biomarkers (distance measure using Euclidean, and clustering algorithm using ward.D)

Fig 6 Summary of pathways analysis with MetPA

Tab 5 Mean changes of major endogenous metabolites in rat plasma of model and YL-IPA08 group compared with control group (VIP value>1)

3 讨论

应用代谢组学技术研究PTSD的内源代谢紊乱已有大量研究报道。暴露于战斗创伤下的男性血浆代谢组学研究结果表明，PTSD可导致能量/碳水化合物代谢、脂质代谢和氨基酸代谢紊乱[11]。PTSD

模型大鼠代谢组学研究显示线粒体功能受损，导致脂质代谢、氨基酸代谢、能量代谢等异常[12]。YL-IPA08是治疗PTSD的全新药物，前期研究结果显示药效明确[3]，但如何调节PTSD导致的内源代谢紊乱值得研究。

本研究应用LC-MS/MS技术支持的靶向和非靶向结合的代谢组学研究YL-IPA08对PTSD模型大鼠血浆中的内源代谢的影响。结果表明，YL-IPA08有可能通过影响氨基酸、磷脂、花生四烯酸等代谢通路逆转PTSD模型大鼠症状，其中谷氨酸代谢通路的相关性最大，脯氨酸和精氨酸等代谢也有影响。通过定量比较各组大鼠血浆中18种胆汁酸含量，发现YL-IPA08对PTSD模型大鼠的胆汁酸异常也有调节作用。

氨基酸分布于体内各处，通过血液循环在各组织之间转运参与代谢，构成氨基酸代谢库，以保证组织对氨基酸代谢的需要。越来越多的证据表明，谷氨酸在情绪、焦虑和创伤相关障碍中的异常功能，谷氨酸神经传递功能障碍越来越被认为是应激相关精神障碍(包括PTSD)的主要特征[13]。经代谢通路拓扑分析，本研究中大鼠PTSD模型主要影响了谷氨酸代谢(impact>0.5)(Tab 7)。模型组大鼠血浆中谷氨酸升高，治疗组大鼠血浆中谷氨酸有回调现象(Tab 5)，表明YL-IPA08可能通过调节谷氨酸异常升高缓解大鼠PTSD症状。

差异代谢物肌酸是与脯氨酸和精氨酸代谢通路相关的关键代谢产物。肌酸可作为能量缓冲剂和能量载体在组织(如大脑和骨骼肌)中提供动态能量需求[14]。研究表明PTSD模型大鼠的内侧前额叶皮质肌酸水平下降，该区域的兴奋性张力下降[15]。肌酸在脑能量稳态中起关键作用。本研究中发现，与对照组相比，PTSD模型组大鼠肌酸含量降低，治疗组大鼠肌酸含量有回调现象，提示YL-IPA08可能通过改善大脑能量代谢发挥作用。

胆汁酸由胆固醇在肝细胞中转化而来，是胆汁的主要成分，其在体内的合成、转运受到多种因素的调节[16]。本研究发现，与对照组相比，模型组PTSD大鼠血浆中11种胆汁酸(LCA、DCA、CDCA、UDCA、HDCA、CA、GCDCA、GCA、DHLCA、GUDCA、GDCA)含量明显上升。文献报道胆汁酸能够激活FXR表达，而FXR的过度表达能降低脑源性神经因子分泌和活性，从而增加机体对精神疾病(PTSD)的敏感性[4]。本研究结果提示胆汁酸的稳态失衡可能导致了PTSD样作用。给予YL-IPA08后，大鼠血浆中的胆酸含量有明显的回调趋势(Tab 6)，表明YL-IPA08能调节PTSD大鼠胆汁酸代谢紊乱。本研究还提示血浆中胆酸可作为YL-IPA08治疗PTSD的潜在生物标志物。

综上，应用代谢组学研究首次发现YL-IPA08对PTSD模型大鼠内源代谢紊乱具有一定的干预作用，其机制可能与调节氨基酸代谢和胆汁酸代谢等有关。目前的结果可为深入研究YL-IPA08治疗PTSD机制提供新线索。