人卵巢癌细胞SKOV3中壳多糖酶3样蛋白1的表达和对细胞增殖及侵袭的影响实验研究

杨立芬，何建清，尹立新，武 军，高 然（.唐山市妇幼保健院妇产科 河北唐山 063000；.唐山市南湖医院急诊科，河北唐山 063000）

卵巢癌是妇科死亡率最高的恶性肿瘤，严重威胁女性生命，卵巢癌具有早期诊断困难、易发生转移的特点[1-3]，且患者预后不良，因此深入探讨卵巢癌的致病机制具有重要意义。壳多糖酶3 样蛋白1（chitinase-3-like-protein-1, CHI3L1），又被称为是一种分泌型糖蛋白，由肿瘤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞和软骨细胞分泌。研究表明在多种肿瘤的增殖、分化、浸润、血管形成和侵袭转移过程中起着重要作用[5-6]。LUO 等[7]人发现CHI3L1 过表达与转移相关，是甲状腺乳头状癌预后不良的一个指标。ANSARI 等[8]人发现脑脊液中星形细胞CHI3L1 驱动HER2+乳腺癌皮层转移。据报道CHI3L1 通过下调p53 促进结肠癌细胞增殖并提高对西妥昔单抗的敏感性[9]。但CHI3L1 在卵巢癌患者中的表达以及其对卵巢癌细胞生物学行为的影响尚不清楚，因此本文通过构建pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒，使得卵巢癌细胞中的CHI3L1 基因沉默，探讨CHI3L1 对卵巢癌细胞SKOV3 增殖、侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象 人卵巢癌细胞SKOV3 购自上海冠导生物工程有限公司，并用含10 g/dl FBS，100 U/ml 青霉素-链霉素的DMEM 培养基进行培养。

1.2 仪器与试剂 BCA 蛋白定量试剂盒、蛋白电泳制胶所需试剂（上海生物工程有限公司）；胎牛血清、DMEM 培养基（美国GIBCO 公司）；慢病毒表达载体 PLL3.7、载体质粒（上海生物工程有限公司） ；PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司） ；Transwell 小室（美国Corning 公司）；荧光显微镜（德国Leica 公司）等。

1.3 方法

1.3.1 构建pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒 ：根据Genbank 中CHI3L1（NM_001276.4）mRNA 序列和pll3.7 质粒图谱，Xho I 和Hpa I 限制酶作为酶切位点，设计引物。将引物进行退火，退火条件为 95℃ 5 min，90℃ 5 min，85℃ 5 min，80℃ 5 min，75℃ 5 min，70℃ 5 min，65℃ 5 min，60℃ 5 min，退火完成后取适量稀释500 倍，4℃ 保存。37℃ 下，在体系中酶切质粒。1%琼脂糖凝胶电泳，之后胶回收纯化DNA，将纯化的 DNA 产物保存于-20 ℃ 。在体系中（Pll3.7 线性载体1 μl 、目的基因7 μl、T4 buffer 1 μl 、T4 连接酶1 μl）进行胶回收产物连接，16℃ 水浴过夜。然后将连接产物转化到DH5α 感受态细胞，成功构建pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒。

1.3.2 细胞转染：将SKOV3 细胞种植在96 孔板中，每孔DMEM 培养液100 μl。1 天后，待细胞处于良好的对数生长期状态时进行转染。实验分为3 组：①空白对照（非转染组）；②阴性对照（转染空载体）；③pll3.7-CHI3L1 shRNA 转染组（转染pll3.7-CHI3L1 shRNA 质粒），在转染试剂中直接加入质粒DNA，混匀后室温静置 10 min。然后在含细胞和完全培养液里加入转染复合物。置于37℃，5ml/dl CO2，饱和湿度条件下培养。在荧光显微镜下观察卵巢癌细胞转染效果。

1.3.3 Western Blot：配制细胞裂解液，制备CHI3L1 蛋白样品，测定蛋白质浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：分别制备浓缩胶和分离胶，上样进行电泳。电泳分离CHI3L1 蛋白后转膜，用封闭液（5g/dl 脱脂奶粉+TBST）进行封闭，室温静置1h。一抗杂交：加入1 ml 封闭液，再加适量的一抗，4℃孵育过夜。室温下，将膜在磷酸盐缓冲液中浸洗3 次，10 min/次。步骤同一抗杂交，取出膜，转移至塑料自封袋中，加入二抗，室温孵育1 h，然后再将膜在磷酸盐缓冲液中浸洗3 次，10 min/次。将混合后的检测试剂均匀加至杂交膜上，反应 3 ～ 5 min。用薄膜覆盖杂交膜，赶出多余发光液，在暗房中压片、显影。通过Western Blot 检测CHI3L1 蛋白的表达。

1.3.4 平板细胞克隆形成试验：用0.25%胰蛋白酶来消化对数生长期的各组细胞，把细胞悬浮在10g/dl 胎牛血清的DMEM 培养液中。把细胞接种到培养液中，并在5 ml/dl CO2，37℃，饱和湿度下培养，直至出现肉眼可见的克隆。弃上清，PBS 浸洗，之后4g/dl 多聚甲醛固定15 min，0.1g/dl 结晶紫染色10～30 min，观察实验结果。

1.3.5 Transwell 实验：制作细胞悬液（制备细胞悬液前先让细胞撤血清饥饿12～24 h，去除血清的影响）。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用无血清培养液重悬。将细胞悬液加入到Transwell 小室，下室一般加入含血清的培养液，上室加入不含血清的培养液。常规培养12～48 h 后观察细胞侵袭能力。取出Transwell 小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS 清洗2 次，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，4 g/dl 多聚甲醛固定30 min，风干。用 0.1g/dl结晶紫染色30～60 min，用PBS 洗3 次，用棉签轻轻擦掉上室水分。显微镜下随机五个视野观察细胞。

1.4 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件对结果进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒的构建及转染效率检测 在荧光显微镜下观察pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒转染卵巢癌细胞48h 后的绿色荧光效果，观察结果见图1。观察到大量的绿色荧光细胞，说明pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒成功转染卵巢癌细胞，且转染效率较高。

图1 pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒转染卵巢癌细胞

2.2 Western Blot 检测pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒转染SKOV3 细胞后CHI3L1 的表达情况 在pll3.7-CHI3L1 shRNA 转染卵巢癌细胞SKOV3 以沉默CHI3L1 基因，转染空载质粒作为阴性对照组（negative control，NC）。转染48 h 后收集SKOV3 细胞。首先通过qPCR 检测转染pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒后CHI3L1 mRNA 的变化，结果显示和空白对照组相比（1.06±0.56），转染NC对CHI3L1 mRNA水平几乎无影响（1.03±0.74），转染pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒后CHI3L1 mRNA 的水平下降（0.41±0.23）。Western Blot 检测CHI3L1 蛋白表达水平，结果见图2。与空白对照组（1.12±0.47）和阴性对照组（0.98±0.54）相比，pll3.7-CHI3L1 shRNA 转染卵巢癌细胞SKOV3后，SKOV3 细胞中CHI3L1 蛋白表达水平下降（0.23±0.41）。

图2 Western Blot 检测pll3.7-CHI3L1 shRNA 转染SKOV3 细胞后CHI3L1 蛋白表达水平

2.3 平板细胞克隆形成试验检测pll3.7-CHI3L1 shRNA 对卵巢癌细胞SKOV3 增殖的影响 通过平板细胞克隆形成试验检测pll3.7-CHI3L1 shRNA 对卵巢癌细胞SKOV3 增殖的影响，结果见图3。与空白对照组（1.05±0.49）和阴性对照组（1.09±0.72）相比，转染pll3.7-CHI3L1 shRNA 后的卵巢癌细胞SKOV3 的细胞克隆数减少，细胞相对克隆形成率降低（0.28±0.46）。说明pll3.7-CHI3L1 shRNA 能抑制卵巢癌细胞SKOV3 的增殖。

图3 平板细胞克隆形成试验检测pll3.7-CHI3L1 shRNA对卵巢癌细胞SKOV3 增殖的影响

2.4 Transwell 实验检测pll3.7-CHI3L1 shRNA 对卵巢癌细胞SKOV3 侵袭能力的影响 通过Transwell实验检测pll3.7-CHI3L1 shRNA 对卵巢癌细胞SKOV3 侵袭能力的影响，结果见图4。与空白对照组（0.94±0.52）和阴性对照组（0.92±0.81）相比，转染pll3.7-CHI3L1 shRNA 后的卵巢癌细胞SKOV3的侵袭能力下降（0.25±0.61）。

图4 Transwell 实验检测pll3.7-CHI3L1 shRNA 对卵巢癌细胞SKOV3 侵袭能力的影响

3 讨论

壳多糖酶3 样蛋白1（CHI3L1），又名几丁质酶3 样蛋白1，是一种分泌型糖蛋白，分子量约40kDa，人类是由CHI3L1 基因编码。CHI3L1 基因位于人类1 号染色体q32 的高度保守区域，含有10 个外显子，基因组长度约10.9 kb，编码383 个氨基酸[10]。有研究揭示：CHI3L1 是一种调控细胞增殖、分化的生长因子，能促进肿瘤细胞增殖、分化；CHI3L1 能促进肿瘤细胞运动和肿瘤侵袭能力；CHI3L1 是血管平滑肌细胞的黏附和迁移因子，可以促进血管生成和组织重塑，而肿瘤血管生成对肿瘤的生长至关重要。有研究表明HCC 组血清CHI3L1均显著高于慢性乙型肝炎组和健康体检组，对HCC 均具有很高的诊断效能[11]。另外发现血清CHI3L1 在肝硬化中具有很好的诊断效能[12]。表明CHI3L1 蛋白可能对肿瘤细胞的生物学行为产生影响。

RNA 干扰技术是利用同源性双链RNA 诱导mRNA 水平上目标基因的沉默，从而起到抑制蛋白产物表达的目的。利用RNA干扰技术分析基因功能，探讨肿瘤的基因靶向治疗。LIBREROS 等[13]人研究发现：利用RNA 干扰技术可以抑制乳腺癌细胞中CHI3L1 的表达，引起趋化因子配体-2、巨噬细胞炎性蛋白-2、基质金属蛋白酶-9 等的分泌减少，从而减弱肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。另外也有学者研究发现：应用RNA 干扰技术沉默CHI3L1 基因，能抑制 CHI3L1 蛋白的表达，从而达到抑制胶质瘤细胞的增殖及侵袭能力的目的[14]。本文成功构建pll3.7-CHI3L1 shRNA 重组质粒，并发现下调CHI3L1 蛋白表达能够抑制卵巢癌细胞SKOV3 的增殖。同时本文通过Transwell 实验来检测结果表明：CHI3L1 蛋白表达水平下调可以抑制卵巢癌细胞SKOV3 的侵袭能力，表明CHI3L1 在SKOV3 细胞中发挥的是癌基因的作用。

综上所述，沉默卵巢癌细胞SKOV3 中CHI3L1基因，可以抑制卵巢癌细胞SKOV3 的增殖和侵袭能力。因此，本研究为卵巢癌的基因靶向治疗提供了一个新的思路，CHI3L1 有可能作为卵巢癌靶向治疗的有效基因靶标。另外，KAWADA 等[15]人的研究发现，在结肠癌细胞中，CHI3L1 主要通过激活胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK） 和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路而产生诱导白介素-8 和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）分泌的。还有文献报道CHI3L1通过MAPK/ERK 和PI3K/AKT 磷酸化在食物过敏中Th2 炎症和M2 巨噬细胞极化中发挥关键作用[16]。在胶质母细胞瘤中，星形胶质细胞增生释放促癌CHI3L1，激活了MAPK 信号通路[17]。细胞内信号通路有很多，考虑到CHI3L1 在其它肿瘤中的作用机制，我们猜想CHI3L1 调控卵巢癌细胞发展的机制也可能是通过信号通路实现的，但是具体作用方式还需要进一步探索。