血清miR-27、PPAR-γ表达与妊娠期糖尿病胰岛素抵抗

王丽娜 刘春梅 胡叶青 庄守存

1.河北省唐山市丰南区胥各庄镇中心卫生院(063300)； 2.河北省唐山市人民医院；3.河北省唐山市丰南区妇幼保健院

妊娠期糖尿病(GDM)发病因素尚未完全明确，但研究认为其与遗传、炎症反应、胰岛素抵抗(IR)、微小RNA(miRNA)、糖脂代谢异常等相关[1-2]。研究发现，miR-27a作为miR-27基因家族重要成员，其在IR细胞中呈高表达，且具有诊治糖尿病IR的潜在价值[3]；另外，过氧化物酶增殖体激活受体-γ(PPAR-γ)在GDM女性中水平异常，其可能在GDM病理发展过程中起重要作用[4]。此外，因IR是GDM发病重要因素，故临床常以稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)判断GDM IR水平，且HOMA-IR在GDM孕妇中水平上调，有助于评估GDM[5]。推测miR-27表达异常与GDM病理变化有关。基于此，本研究拟通过初步检测GDM孕妇血清miR-27、PPAR-γ水平，分析两者相关性，以期为临床诊治GDM提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院与唐山市丰南区妇幼保健院合并以来2017年5月-2020年7月诊治的GDM孕妇(GDM组)，按有关诊疗指南标准诊断[6]。纳入标准：单胎妊娠，符合GDM相关诊断标准；检查资料完整，自愿配合完成研究。排除标准：①合并甲状腺疾病、肝肾功能不全、垂体肾上腺、高血压；②孕前患有糖尿病；③合并恶性肿瘤、多囊卵巢综合征；④有吸烟、饮酒不良嗜好；⑤有分娩多胎、畸形胎儿、宫内生长受限胎儿、死胎史；⑥辅助生殖技术受孕。同期产前检查健康孕妇(对照组)。孕妇及家属签署知情同意书，研究符合经本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1样本采集收集孕妇空腹外周静脉血置无菌真空管中，均分成两份。一份于室温下静置30min，离心分离血清，检测血清miR-27、PPAR-γ水平；另一份置含肝素抗凝管中离心分离血浆，检测空腹胰岛素(FINS)、空腹血糖(FBG)水平。检测送本市三甲医院完成。

1.2.2血清miR-27检测实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法。取适量冻存血清冰上解冻，加适量cel-miR-39(校正血清miR-27水平)，按miRNA纯化试剂盒(上海富衡生物科技有限公司)说明纯化miRNA。根据microScript microRNA cDNA Synthesis Kit(艾美捷科技有限公司)说明书获取cDNA。参照miRNA qRT-PCR Kit(北京博迈斯科技发展有限公司)说明书配反应体系，利用qRT-PCR仪(上海力新仪器有限公司)扩增。引物均由上海生工生物工程公司合成，以2-△CT法分析血清miR-27相对表达量，其中△CT=目的基因CT值-cel-miR-39 CT值。

1.2.3血清PPAR-γ检测酶联免疫吸附法(ELISA)。取出人PPAR-γ ELISA试剂盒(上海瓦兰生物科技有限公司)，依照其说明书将标准品配制成一系列浓度的标准品溶液，检测标准品溶液的吸光度，绘制PPAR-γ标准回归曲线；解冻适量血清，室温下平衡20 min，于酶标板中加血清，37℃培养箱中孵育30min，加生物素工作液(含PPAR-γ抗体)，37℃孵育50min 后弃反应液，磷酸缓冲液洗3次后 加显色液，37℃孵育30min 加终止液，利用酶标仪(上海格索普生物科技有限公司)测定样本450nm处吸光度值，计算血清PPAR-γ浓度。

1.2.4检测IR相关指标解冻适量血浆，利用人胰岛素试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)按化学发光法检测FINS水平；利用葡萄糖测定试剂盒(上海榕柏生物技术有限公司)及全自动生化分析仪(北京益仁恒业科技有限公司)检测FBG水平。利用HOMA-IR评价IR水平，HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般临床资料

GDM组131例，年龄(29.9±6.1)岁(23～38岁)，孕周(33.9±3.6)周(28～38周)；产次(1.8±0.8)次(1～3次)；孕前体质量(54.8±6.5)kg(48～65 kg)。对照组135例，年龄(30.1±6.2)岁(23～38岁)；孕周(34.1±3.6)周(28～38周)；产次(1.7±0.7)次(1～3次)；孕前体质量(55.0±6.6)kg(47～66 kg)。两组上述指标无差异(P>0.05)。

2.2 血清miR-27、PPAR-γ水平

与对照组相比，GDM组血清miR-27水平升高，PPAR-γ水平降低， FINS、FBG、HOMA-IR水平GDM组均高于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组血清各检测指标水平比较

2.3 GDM孕妇血清各指标相关性

Pearson法分析显示，GDM孕妇血清miR-27水平与HOMA-IR呈正相关(P<0.05)，血清PPAR-γ水平与HOMA-IR呈负相关(P<0.05)。见表2。GDM孕妇血清miR-27水平与PPAR-γ呈负相关(r=-0.457，P<0.05)。见图1。

表2 GDM孕妇血清miR-27、PPAR-γ水平与FINS、FBG、HOMA-IR的相关性

图1 GDM孕妇血清miR-27水平与PPAR-γ的相关性

3 讨论

GDM可导致产妇发生感染、流产，升高畸形胎儿、极低体重儿、新生儿低血糖发生率，对母婴健康构成极大威胁[7]。且GDM诊疗有一定局限性，寻找与GDM发病相关因素及时干预，对改善孕妇及胎儿结局有积极意义。

miRNA是稳定存在于血清、血浆的RNA小分子，其可调控自噬、信号转导、氧化应激、细胞发育、炎症反应等生理病理过程，与糖尿病肾病、糖尿病、肥胖、GDM发病进程关系密切[8-9]。研究发现，miR-27可通过与靶基因PPAR-γ结合影响脂肪细胞分化、增殖、脂肪代谢、胰岛素信号传导及炎症反应[10]。体外研究显示，miR-27a可通过调节胰岛素信号通路及靶向作用PPAR-γ，进而影响脂肪细胞IR[11]；另外在2型糖尿病患者血清中表达上调[12]。以上研究表明，miR-27表达失调可能与IR类疾病显著相关。本研究中GDM组孕妇血清miR-27表达水平高于对照组，推测高水平miR-27可能通过靶向相关基因，影响有关信号传导途径促进炎症反应，进而调节血糖代谢，促进IR[3]，从而影响GDM疾病进展。具体机制仍有待研究证实。

PPAR-γ可影响胎盘发育、胎盘滋养层细胞分化、能量代谢，调节血压，抑制炎症反应，与糖尿病、糖尿病肾病、GDM病变过程密切相关[13-14]。研究发现，PPAR-γ在GDM孕妇胎盘中水平异常，可能通过影响炎症反应在GDM疾病进展中发挥作用[15]；另外，动物实验研究显示，PPAR-γ在妊娠糖尿病大鼠中表达下调，经肉桂醛给药后表达上调，PPAR-γ可能参与并影响妊娠糖尿病[16]。以上研究表明，PPAR-γ异常表达可能与GDM有关。本研究中GDM组孕妇血清PPAR-γ水平低于对照组，提示PPAR-γ可能在GDM病理过程中起作用，究其原因，低水平PPAR-γ抑制炎症能力降低，使糖脂代谢紊乱，影响胎盘代谢及IR，从而影响GDM发生发展过程，但作用机制仍需深入探究证实。

IR是一种由各种因素引发胰岛素作用的细胞、组织器官利用葡萄糖能力降低的病理状态，可由生理性发展成GDM[17]。研究发现，FINS、FBG、HOMA-IR在GDM孕妇中水平均上升，且HOMA-IR是GDM发生的危险因素，患者对胰岛素敏感性降低[18]。本研究中GDM组孕妇FINS、FBG、HOMA-IR水平均高于对照组，与谭晶等[18]研究结果相符，提示IR与GDM发病进展相关。

朱磊等[19]研究显示，低氧训练可通过miR-27影响靶基因PPAR-γ表达进而改善血脂水平，影响体脂含量。本研究探讨GDM孕妇血清指标相关性显示，血清miR-27水平与PPAR-γ呈负相关，提示miR-27可能与PPAR-γ相互影响共同影响GDM病情进展，但具体影响机制有待深入研究证实。本研究GDM孕妇血清miR-27水平与HOMA-IR呈正相关，PPAR-γ水平与HOMA-IR呈负相关，提示miR-27、HOMA-IR可能与IR相互作用共同在GDM进展中发挥作用。

综上所述，GDM孕妇血清miR-27水平上调，PPAR-γ水平降低，两者呈负相关，其可能与IR相互影响，进而共同影响GDM疾病过程，miR-27、PPAR-γ可能是诊治GDM的潜在靶标。但本研究未对miR-27、PPAR-γ在GDM中机制进行深入探究，后续将加大样本量进一步探讨。