反复胚胎移植失败与首次胚胎移植成功不孕症患者阴道微生态特点差异

刘艳君 卜晓萌 张巧利 马延敏

首都医科大学附属北京妇产医院(100026)

体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET)及其衍生技术是目前临床治疗女性不孕症的最有效手段之一，但应用过程中成功率在50%～60%，反复胚胎移植失败仍是IVF-ET应用中需解决的问题[1]。女性生殖道微生态系统由生殖道微生物菌群、宿主内分泌系统状态、阴道解剖结构以及局部免疫系统组成[2]。正常情况下阴道以乳杆菌为优势菌，同时并存多种微生物，与宿主生殖系统相互依赖并相互制约，这种生态平衡对提高女性生殖系统抵御其他病原微生物侵袭具有重要作用[3-4]。生殖系统感染是导致女性不孕重要因素。因此，研究并分析不孕症女性的生殖道微生态特点对改善患者妊娠结局、提高胚胎移植成功率有至关重要意义。本研究通过分析反复胚胎移植失败与首次胚胎移植成功的不孕症患者阴道菌群微生态特点差异，为临床治疗提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年2月-2019年10月在本院接受胚胎解冻移植(FET)反复失败(失败组)和首次胚胎移植成功(成功组)的不孕症患者临床资料。纳入标准：①反复胚胎移植失败诊断标准为行≥3次胚胎移植未孕或植入≥10枚优质胚胎仍未受孕；②内分泌检查无异常；③月经周期正常；④入组前6月无宫腔检查史，无激素和抗生素等影响检查结果的药物服用史；⑤患者及家属对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：①子宫畸形；②息肉、肿瘤等宫腔异常；③合并宫腔黏连、输卵管重度积水及子宫内膜结核等病史；④合并甲亢、糖尿病、心脏病等内科疾病；⑤其他已明确导致反复胚胎移植失败的患者。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 方法

1.2.1标本采集常规准备消毒后，取清洁干棉签自患者阴道上1/3至宫颈口处刮取分泌物，涂抹于载玻片上，另取清洁干棉签再次于相同部位刮取分泌物并放入无菌试管内。

1.2.2标本检测采用卡尤迪医学检验实验室阴道炎自动检测工作站(包括镜检系统)、阴道炎联合检测试剂盒以及革兰染色液对标本进行检测。参考中华医学会妇产科学分会感染性疾病协作组制定的《阴道微生态评价的临床应用专家共识》进行阴道菌群微生态特点分析。微生态检测包括形态学检测和功能学检测两方面：形态学检测，涂抹分泌物的载玻片经干燥、固定和革兰染色后置显微镜下，观察菌群多样性、密集度、优势菌群、病原微生物、炎性反应等指标。功能学检测，取1支清洁软管并滴加5～7滴稀释液，将带有分泌物的棉签插入无菌软管中顺时针旋转4～5次，使棉签上的分泌物与稀释液充分混合为检测样本。采用阴道炎自动检测工作站行功能学检测，检测白细胞酯酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、唾液酸苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、PH值。

1.2.3阴道菌群微生态失调诊断标准正常阴道微生态为菌群多样性II-III级，菌群密集度II-III级，以乳杆菌为优势菌，PH值在3.8～4.5，H2O2分泌水平正常，白细胞酯酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、唾液酸苷酶、β-葡萄糖醛酸酶等阴性，当菌群多样性、密集度、优势菌群、PH值、H2O2分泌水平、机体炎性反应标志物及病原微生物代谢产物等任一指标为阳性，即诊断为微生态失调。微生态失调包括细菌性阴道病(BV)、中间型细菌性阴道病、需氧型阴道炎(AV)、外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)、滴虫性阴道炎(TV)等。具体诊断标准参考文献[5]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

共纳入符合标准患者157例，其中失败组77例，年龄(33.3±4.1)岁(28～38岁)，不育(6.1±3.7)年(5～12年)，子宫内膜厚度(0.9±0.2)cm。成功组80例，年龄(32.6±3.5)岁(26～36岁)，不育(6.0±3.1)年(4～10年)，子宫内膜厚度(0.9±0.2)cm。两组比较无差异差异，移植胚胎均为优质D3胚胎。

2.2 阴道微生态形态学检测

失败组阴道分泌物菌群多样性(I级和IV级)、菌群密集度(I级和IV级)、滴虫检测阳性的患者比例均高于成功组(P<0.05)，而真菌检测占比与成功组无差异(P>0.05)，以乳杆菌为优势菌的患者占比低于成功组(P<0.05)，两组患者Nugent评分有差异(P<0.05)。见表1。

表1 两组阴道微生态形态学各检测指标比较[例(%)]

2.3 阴道微生态功能学检测

失败组阴道宫腔分泌物检测结果PH>4.6、白细胞酯酶阳性、乙酰氨基葡萄糖苷酶阳性、唾液酸苷酶阳性、β-葡萄糖醛酸酶阳性的患者比例高于，分泌物过氧化氢充足占比低于成功组(均P<0.05)。见表2。

表2 两组阴道微生态各功能学各检测指标比较[例(%)]

2.4 阴道微生态失调类型

诊断为微生态失调失败组有43例(55.8%)患者，成功有11例(13.8%)，两组相比有差异(P<0.05)。微生态失调类型方面，失败组中间型BV、BV、AV、TV的检出率高于对照组(P<0.05)，VVC、BV+VVC、中间型BV+VVC的检出率两组相比无差异(P>0.05)。见表3。

表3 两组阴道微生态失调类型比较[例(%)]

3 讨论

辅助生殖技术(ART)发展使不孕患者妊娠率不断提高，但临床上仍有部分患者接受多次优质胚胎移植后仍然不能受孕[6]。导致反复胚胎移植失败[7-8]。探讨该类人群反复胚胎移植失败原因非常重要。女性生殖道微生态体系为动态变化的体系，正常的微生物菌群是维持其稳态的核心内容之一[9]。近年生殖道微生态学也作为一门独立学科日益受到医学界关注，通过将微生态学与临床感染性疾病以及基础微生物学的研究相结合，评价不孕症女性阴道菌群微生态环境，从而为临床诊疗及预后评估提供科学指导[10-11]。

生殖系统感染是临床上的常见疾病之一，也是导致女性不孕症的重要原因之一。此外，女性生殖系统感染还可借助多种机制诱导机体免疫损伤，导致内源性抗子宫内膜抗体和抗精子抗体的产生，降低精子活性及精子与卵细胞的结合几率，最终导致女性不孕症的发生[12-13]。本研究通过对比分析反复胚胎移植失败和首次胚胎移植成功的不孕症患者的阴道微生态学特点，结果显示，失败组阴道分泌物菌群多样性、菌群密集度、滴虫检测、Nugent评分、PH值以及常见病原微生物代谢产物和酶的活性检测结果与成功组相比均存在差异。正常的微生态特点为以乳杆菌为优势菌，PH值在3.8～4.6之间，失败组优势菌群改变，PH值明显升高，对病原微生物的清除能力大大降低，可引起多种生殖道炎症的发生，导致精子与卵细胞结合受阻[14-15]。失败组微生态失调发生比例高于成功组。微生态失调类型方面，失败组中间型BV、BV、AV、TV的检出率及生殖道病原微生物感染率均高于成功组。因此，生殖道微生态失调可能是影响胚胎种植的重要因素之一。

综上所述，不孕症患者反复胚胎移植失败者阴道微生态失调占比更高，提示临床上应重视对不孕症患者实施辅助生殖技术前微生态环境的检测，及时治疗，以提高胚胎移植成功率。