楮实子多糖提取工艺及抗皮肤光老化能力研究*

祁永华，吴 迪，张晏航，吴鹏程，张 宁

（1.黑龙江中医药大学 佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

皮肤光老化主要机制为中波紫外线（UVB）穿透皮肤表皮层，导致皮肤内活性氧（ROS）的过量产生[1]，而ROS 可诱导基质金属蛋白酶（MMPs）活性增加，破坏细胞外基质，导致皱纹等皮肤老化症状的出现[ 7]。

楮实子化学成分主要包括生物碱、氨基酸、多糖等[2]。具有抗衰老、抗氧化等药理作用[3,4]。为了了解楮实子多糖的抗氧化活性，有必要确定合理可行的提取工艺。本研究以正交试验确定多糖的最佳提取工艺后，采用UVB 辐射人皮肤成纤维细胞复制光老化模型，研究楮实子多糖的抗氧化活性，为楮实子多糖在抗皮肤光老化方面提供实验支持。

1 实验部分

1.1 药品与试剂

人皮肤成纤维细胞（ESF-1，北京协和细胞资源中心）；楮实子（批号：191003 购自佳木斯市百盛药材公司，经黑龙江中医药大学陈效忠教授鉴定为桑科植物构树Broussoneria papyrifera（L.）Vent.的干燥成熟果实）；D-无水葡萄糖对照品（批号：110833-201205，中国食品药品检定研究院）；DMEM 培养液、胰蛋白酶、PBS，Gibco 公司；胎牛血清、二甲基亚砜、MTT，Sigma 公司。

1.2 主要仪器

YT-SY96 型酶标仪（上海热电仪器有限公司）；8-5K 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；FZ-A 型紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂）；IX-71-21PH 型Olympus 倒置显微镜（日本Olympus 公司）；MS-500E 型半自动生化分析仪（四川美生公司）。

1.3 楮实子多糖提取工艺

1.3.1 楮实子多糖的提取 楮实子干燥后粉碎，称取50g，加入750mL 蒸馏水，浸泡120min，置于水浴锅中升温至80℃，趁热过滤，滤液浓缩至50mL，待冷却后按照醇沉比1∶4 加入无水乙醇，放置过夜，离心，收集沉淀，用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，即得楮实子粗多糖。

1.3.2 楮实子多糖含量测定 准确称取葡萄糖对照品0.15g，定容至100mL 容量瓶中，制成浓度为1.5mg·mL-1的储备液。取储备液适量，配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg·mL-1的浓度梯度，并分别加入1mL 苯酚和5mL H2SO4后混匀，于沸水浴中加热10min，冷却至室温，测定吸光度（490nm），分别以浓度和吸光度为横、纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=6.550X+0.0423（r=0.9997），线性范围为0～0.10mg·mL-1。取楮实子多糖提取液0.5mL，用2mL水稀释，量取稀释液1mL，加入1mL 苯酚和5mL H2SO4后混匀，于沸水浴中加热10min，冷却至室温，测定吸光度并计算楮实子多糖含量。

1.3.3 单因素试验优化楮实子多糖提取工艺

（1）提取温度与楮实子多糖含量的关系 按照“1.3.1”项下的方法提取多糖、“1.3.2”项下的方法测定多糖含量，其他条件不变，比较在40、60、80、100℃的多糖含量，每个试验重复3 次。

（2）提取次数与楮实子多糖含量的关系 按照“1.3.1”项下的方法提取多糖、“1.3.2”项下的方法测定多糖含量，其他条件不变，比较提取1、2、3、4 次的多糖含量，提取次数两次或超过两次的提取液需合并滤液后再浓缩至50mL，每个试验重复3 次。

（3）料液比与楮实子多糖含量的关系 按照“1.3.1”项下的方法提取多糖、“1.3.2”项下的方法测定多糖含量，其他条件不变，比较料液比为1 号（1∶10）、2 号（1∶15）、3 号（1∶20）、4 号（1∶25）、5 号（1∶30）对楮实子多糖含量的影响，每个试验重复3 次。

1.3.4 楮实子多糖提取工艺优化的正交试验 根据单因素试验结果，试验以提取温度、提取次数和料液比例为考察因素，设置每个因素3 个水平，采用四因素三水平正交试验表（L9（34））设计正交试验，以多糖含量为指标筛选最佳工艺。见表1。

表1 L9（34）正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.3.5 多糖提取工艺的验证试验 按照正交试验筛选的最佳试验条件，重复进行3 次试验，测定楮实子多糖含量，评价优化后工艺的合理性。

1.4 楮实子多糖抗皮肤光老化能力

1.4.1 光老化模型建立 将处于对数生长期的ESF-1 用0.25%胰酶消化后接种于96 孔板，培养24h。待细胞全部贴壁后移除培养液，每孔加入100μL PBS 缓冲液，置于强度为70mJ·cm-2的中波紫外光下进行照射，用紫外线强度检测仪监测强度，空白组不予照射。各试验组移除PBS 缓冲液后，按试验分组加入相应DMEM 培养液或含药DMEM 培养液继续培养。

1.4.2 试验分组 将处于对数生长期的ESF-1 接种于96 孔板，分为空白组、模型组、维生素E 组（阳性组）、给药组，各组均设5 个复孔。空白组给予DMEM 培养48h，模型组、维生素E 组、给药组于70mJ·cm-2的UVB 照射后，分别给予DMEM 培养液、含维生素E 500μg·mL-1DMEM 培养液、含楮实子多糖500μg·mL-1DMEM 培养液继续培养。

1.4.3 指标测定 取各组细胞上清液，按照SOD、MDA、GSH-PX 试剂盒说明书进行操作，分别测定其指标变化，以考察楮实子多糖抗UVB 所致细胞氧化损伤。

1.4.4 数据处理 采用SPSS 21.0 统计软件进行分析。两组间比较用独立样本t 检验，P<0.05 说明差异有显著性意义。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度的影响

图1 为提取温度与楮实子多糖含量的关系图。

图1 提取温度与楮实子多糖含量的关系Fig.1 Relationship between extraction temperature and content of Fructus Broussonetiae polysaccharides

由图1 可见，随着提取温度的升高，楮实子多糖含量亦随之增高，表明升高温度有利于楮实子多糖的提取，然而当温度升至80℃后含量曲线接近与横轴平行，表明随温度升高楮实子多糖含量无明显变化，因此，选择优化温度范围为70～90℃。

2.1.2 提取次数的影响

图2 为提取次数与楮实子多糖含量关系图。

图2 提取次数与楮实子多糖含量的关系Fig.2 Relationship between extraction times and content of Fructus Broussonetiae polysaccharides

由图2 可见，随提取次数增加，多糖含量先大幅度增加后小幅度下降，原因为提取次数增加，提取液的量增加，浓缩时间延长，使少量植物多糖降解。当提取次数为2 次时，楮实子多糖含量最高，因此，选择优化提取次数为1～3 次。

2.1.3 料液比的影响

图3 为料液比与楮实子多糖含量的关系图。

图3 料液比与楮实子多糖含量的关系Fig.3 Relationship between solid-liquid ratio and content of Fructus Broussonetiae polysaccharides

由图3 可见，料液比对多糖含量的影响呈先升高后小幅降低的趋势，虽然料液比例1∶30 比1∶25提取的含量有所降低，但楮实子多糖含量仍高于料液比1∶20，其中料液比为1∶25 时效果最好，因此，选择优化范围为1∶20～1∶30 设计正交试验。

2.2 多糖提取工艺优化的正交试验

表2 为正交试验设计及结果。

表2 正交试验设计及结果（n=3）Tab.2 Design and result of orthogonal experiment

由表2 可见，极差分析结果表明因素影响的次序为A>C>B，说明提取温度是影响多糖提取的主要影响因素，最优组合为A2B2C3。

方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Tab.3 Result of analysis of variance

温度对多糖提取效果有极显著影响，料液比对多糖提取效果有显著性影响，提取次数对多糖提取效果无显著影响。最终确定的最佳工艺为提取温度80℃，提取次数2 次，料液比1∶25。

2.3 多糖提取工艺的验证试验

按照最优组合平行制备的3 批样品多糖含量分别为：10.35%，10.69%，10.27%，RSD<3，表明工艺合理、可行，重复性好。

2.4 楮实子多糖对SOD、MDA、GSH-PX 水平的影响

由图4 可见，与空白对照组比较，模型组SOD、GSH-PX 水平显著下降，MDA 水平显著升高（P<0.05），表明光老化模型复制成功。与模型组比较，维生素E组与楮实子多糖组SOD、GSH-PX 水平明显升高（P<0.05），MDA 水平明显降低（P<0.05），表明楮实子多糖有抗UVB 致皮肤成纤维细胞氧化损伤作用。

图4 楮实子多糖对皮肤成纤维细胞SOD、MDA、GSH-PX水平的影响Fig.4 Fructus Broussonetiae polysaccharides effect on level of SOD、MDA、GSH-PX

3 结论

本研究通过单因素试验考察了楮实子多糖提取温度、提取次数及料液比对多糖含量的影响，确定了适宜范围，采用L9（34）正交试验法对多糖的提取方法进行优化，确定最佳提取温度为80℃，提取次数为2 次，料液比为1∶25，多糖平均含量为10.44%，提示优化后的多糖提取工艺合理可行。

人皮肤长期处于UVB 照射下，细胞内ROS 水平显著升高，引发脂质过氧化及DNA 损伤[6]。正常情况下，SOD、GSH-PX、维生素E 等抗氧化剂对ROS 有清除能力，过量的ROS 能使机体自身抗氧化防御系统失衡，细胞遭受氧化应激损伤，MDA 含量升高，最终导致皮肤光老化。本研究通过皮肤成纤维细胞复制光老化模型，对楮实子多糖的抗氧化活性进行了研究，初步证明了楮实子多糖的体外抗氧化活性，有用于抗老化中药化妆品领域的潜力。