HPLC同步检测四味穿心莲散中绿原酸和芦丁的含量

姜煜倩， 姚 丹， 王宏军*， 谭 婷， 李佳佳，单文琪， 张 达， 蒋 红， 胡昭伟

（1.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁锦州121001；2.锦州市北山农垦有限责任公司，辽宁锦州121000）

四味穿心莲散由穿心莲、辣蓼、大青叶、葫芦茶四味中草药组成，具有清热解毒、除湿化滞的功能，主治鸡泻痢、积滞。陶松若等（2020）研究表明，四味穿心莲散水煎液体外对沙门氏菌有抗菌活性；陈建蓉等（2009）、王林等（2017）、班燕桃等（2020）均用薄层色谱法（TLC）对四味穿心莲散中大青叶相关成分进行了检测分析；王艳秋等（2013）、包爱情（2016）用高效液相色谱法（HPLC）对四味穿心莲散中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯进行了检测，鲜见对该组方中其他成分的HPLC检测。鉴于此，本实验以甲醇为提取溶剂，旨在建立HPLC同步测定四味穿心莲散中绿原酸与芦丁的方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 高效液相色谱仪：L-7420（日本日立公司），配四联泵、脱气泵、紫外检测器和柱温箱；色谱柱：岛津InertSustian C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）（天津市尚亚科技发展有限公司）；旋转蒸发仪：RE-5203型（上海亚荣生化仪器厂）；超声波清洗器：KQ-300B（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 主要试剂 甲醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市津东天正精细化学试剂厂）；磷酸（分析纯，天津南开大学精细化工股份有限公司）；穿心莲、辣蓼、大青叶、葫芦茶购自辽西国药店；绿原酸、芦丁对照品购自成都曼思特生物科技有限公司。

1.3 色谱条件 流动相：乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱，有机相洗脱梯度为0～20 min，12%～18%乙腈；20～30 min，18%～19%乙腈；30～36 min，19%～20%乙腈；36～43 min，20%～25%乙腈；43～48 min，25%～12%乙腈。流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：355 nm；进样量：10 μL。

1.4 样品处理 将穿心莲、辣蓼、大青叶、葫芦茶4味中草药按照《中国兽药典》收载处方配比粉碎，称取复方中草药粉末5.0 g。按1:20料液比加入40%甲醇，浸泡1 h，超声处理30 min后，离心取上清，旋转蒸发浓缩至干。用1 mL甲醇溶解，即为待测样品。

1.5 实验方法

1.5.1 线性考察 将绿原酸、芦丁用甲醇稀释成0.1～0.9 mg/L系列工作标准液，进行液相色谱分析。每个浓度点重复测定3次，取平均值绘制色谱峰面积-浓度标准曲线。

1.5.2 加样回收率 称取6份已测定了绿原酸和芦丁含量的复方中草药提取物样品0.1 g，按1.4中的方法制备供试溶液，加入适量混合标准液，在1.3中色谱条件下检测，重复6次，分析样品回收率。

2 结果与分析

2.1 色谱分离 由图1可知，在色谱条件下，绿原酸、芦丁得以良好的分离，且绿原酸、芦丁2种化合物的保留时间分别为12.832、33.165 min。

图1 样品和对照品HPLC色谱图

2.2 标准曲线 将对照品系列浓度分别进样检测，以色谱峰面积（S）和对照品浓度（C，mg/L）作线性回归。在浓度为0.1～0.9 mg/L内，绿原酸的标准曲线为S=5×107C+5171，R2=0.9994，芦丁的标准曲线为S=1×108C-2187，R2=0.9992。

2.3 加样回收率 由表1可知，绿原酸的平均回收率为98.41%，RSD为0.62%；芦丁的平均回收率为98.12%，RSD为0.54%。

表1 加样回收率

2.4 精密度与重现性实验 应用上述建立的方法测定了在12 h内不同时间段样品中绿原酸、芦丁的含量，每个时间段重复进样5次，6个时间段中绿原酸的平均含量为（4.90±0.10）mg/g，RSD为2.04%；芦丁的平均含量为（5.47±0.06）mg/g，RSD为1.10%。结果表明本方法具有很好的精密度和重现性。

3 结论

本实验以乙腈-0.1%磷酸水为流动相进行梯度洗脱，在检测波长为355 nm条件下，利用HPLC同步检测四味穿心莲散中草药提取物中绿原酸、芦丁的方法基线稳定，重复性理想，相对标准偏差＜1%，线性关系良好，两种组分分离理想，回收率高，能够满足检测需求。从样品HPLC图谱中可以发现，在该条件下还可以分离检测到其他成分，这些成分的鉴定、确认有待进一步研究，但是在该条件下未能检测到穿心莲内酯，这与设定的检测波长有直接关系。由此可见，利用高效液相分离、紫外检测器同步检测复方中草药提取物多种、多类成分有一定局限性，利用高效液相色谱法与质谱法应该可以加快该领域的研究，能够更加准确评价复方中草药制剂中的成分组成。所以本方法仅可以作为HPLC同步检测四味穿心莲散中绿原酸、芦丁的一种比较理想的方法。