六羟基黄酮的抑菌及抗氧化性研究

孙 磊， 吴娟娟， 王欢欢， 陈宝江，2*， 吴 迪*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定071000；2.河北省牛羊胚胎技术创新中心，河北保定071000；3.晨光生物科技集团股份有限公司，河北邯郸056000）

畜牧业的健康发展对保证中国农业健康发展和提高人民生活水平十分重要，在饲料中添加抗生素有改善动物机体机能和促进营养吸收的作用。但近年来越来越多研究表明，抗生素的使用会加速畜禽耐药性的出现，同时还会造成畜产品中抗生素残留，进而会影响食品安全和公共卫生安全。因此，寻求抗生素替代成为动物营养研究的热点。

动物由于饲料、环境等多种原因，肠道中经常感染有害细菌，常见的有大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、奇异变形菌等（史同瑞等，2013），这类有害菌寄生在肠道内，可引起腹泻，危害动物的健康和生产性能，甚至引发畜禽死亡（季秋晴等，2018）。同时，由于饲料中长期添加抗生素，已经产生抗药性（孙和涛，2013）。因此，筛选合适的抑菌产品意义重大；另外，集约化饲养管理、饲养环境、运输等多种因素，又会使动物处于长期应激状态，体内自由基超量产生，健康受损。

研究表明，植物中的黄酮类物质，不仅有一定抑菌消毒能力，还具有抗氧化、抗辐射等良好作用（Manjinder等，2014）。饲粮中添加黄酮类化合物可有效提高机体抗氧化能力，从而有效增强机体抵抗力（徐国银，2007）；日粮中添加某种黄酮类化合物可起到清除自由基，增强仔猪抗病和抗肿瘤性，减少腹泻率的作用（赵萌等，2016）。此外，黄酮类还具有帮助改善家畜的胃肠道血管黏膜湿润状态、调节家畜肠道益生菌群以及帮助缓解热应激等特殊营养功效。

六羟基黄酮主要存在于黄芩的根、茎皮等部位，也可以通过化学方法合成（乔宇和石波，2019），有保肝、抗癌、抗炎等多种药物治疗以及保健作用（王放等，2016）。但对其抑菌效果及抗氧化性能的研究鲜见报道。本试验以六羟基黄酮为对象，研究其对畜禽肠道常见有害菌的抑菌效果及抗氧化能力，为其在饲料上的使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌种 有害菌：冻干菌粉金黄色葡萄球菌（ATCC6538）、肠沙门氏菌肠亚种（ATCC13076）、奇异变形杆菌（CMCCB 49005）、大肠埃希氏菌（CICC 10899），购于国家菌种保藏中心。

1.2 试验试剂 六羟基黄酮：由万寿菊中提取，晨光生物科技集团股份有限公司提供；营养琼脂、营养肉汤、无水乙醇、水杨酸、H2O2、维生素C、Fe-SO4·7H2O、DPPH等，均为分析纯。

1.3 仪器与设备DSHG-300A型水浴恒温振荡器；SPX-250B-Z型生化培养箱；SW-CJ-1B型洁净工作台；QL-861型螺旋振荡器；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器；ELx800型酶标仪；722型可见分光光度计；96孔板（Costar公司）。

1.4 抑菌活性测定 本试验采用标准的牛津杯法，通过测定抑菌圈大小来检测六羟基黄酮对4种菌的抗菌作用。抑制细菌圈小于10 mm，为低程度敏感；10～15 mm，为中等程度敏感；15～20 mm，为高度敏感；20 mm以上，为极度敏感。

1.5 最小抑菌浓度测定 本试验最小抑菌浓度（MIC）采用二倍稀释法检测。

细菌百分抑制率/%=1-细菌生长百分比（%）。

1.6 抗氧化性测定 取1 g六羟基黄酮于250 mL锥形瓶中，按1:50比例加入六羟基黄酮和提取液，60%的酒精溶液提取，60℃下水浴振荡30 min。过滤，100 mL容量瓶收集滤出液体至容量瓶的刻度线。

1.6.1 水杨酸法对·OH清除能力 按照浓度顺序分别添加2 mL不同体积的样品于10 mL PC离心管中，浓度梯度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 mL，再加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液、1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，随后加入超纯水使反应体系达到10 mL。37℃静置30 min。测定吸光度Ax。空白组以相同体积的超纯水替代六羟基黄酮，其他步骤相同，记为A0。测定Ax和A0时以超纯水为参比溶液。·OH清除率的计算公式为:

式中：A0为空白的吸光度值；Ax为加样品的吸光度值。

1.6.2 DPPH法测定清除能力DPPH溶液配制：0.0197 g DPPH溶解于250 mL无水乙醇。依次分别 加 入 样 品 液0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、6.0 mL于10 mL离心管中，再加入0.2 mmol/L DPPH 2 mL，添加酒精溶液使反应体系达到8 mL，避光30 min后517 nm测吸光度Ax，此为试验组。空白组用一样体积的乙醇代替样品液，测得吸光度A0。对照组用乙醇代替DPPH溶液，测得吸光度Aj。测定Ax、Aj和A0时以无水乙醇为参比溶液。DPPH清除率计算公式为：

式中：Ax为加样品的吸光度值；Aj为对照的吸光度值；A0为空白的吸光度值。

2 结果

2.1 六羟基黄酮对4种有害菌的抑制效果 由表1可以看出，六羟基黄酮对4种有害菌均有抑制作用。当其浓度为5 mg/mL时，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌抑制均达到中等敏感程度，奇异变形菌达到高程度敏感；20 mg/mL以后，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、奇异变形菌均达到高程度敏感。在本试验范围内，抑菌圈能力随六羟基黄酮浓度增高而变大。

表1 六羟基黄酮对4种有害菌的抑菌效果mm

2.2 六羟基黄酮对4种有害菌的最小抑菌浓度由表2可以看出，六羟基黄酮对奇异变形菌MIC最小，为0.125 mg/mL；其次为金黄色葡萄球菌与大肠杆菌；对肠沙门氏菌MIC最大。

表2 六羟基黄铜对4种有害菌最小抑制浓m度g/mL

2.3 六羟基黄酮对·OH的清除率 由表3可知，在样品量为2.00～4.50 mL（浓度梯度0.03～0.26 mg/mL），六羟基黄酮对·OH的清除能力随浓度增大逐渐增长，在样品量4.50～6.50 mL（浓度梯度0.26～0.37 mg/mL），清除率趋于平缓，在样品量6.50 mL（0.15 mg/mL浓度）清除率最高，为86.67%。在相同梯度下，六羟基黄酮对·OH的清除能力略低于维生素C。

表3 六羟基黄酮对·OH的清除效果%

2.4 六羟基黄酮对DPPH的清除率 由表4可知，DPPH的清除能力随着六羟基黄酮浓度的增大逐渐加强。在样品量0.6～4.8 mL（浓度梯度0.01～0.11 mg/mL），DPPH清除率稳步增加，在样品量4.8 mL（浓度梯度0.11 mg/mL）时，清除率到最高，为96.69%，在样品量4.8 mL（0.11 mg/mL浓度）之后清除率逐渐平缓。并且在此梯度以上，六羟基黄酮的最大清除比率明显高于维生素C。

表4 六羟基黄酮对DPPH的清除效果%

3 讨论

3.1 六羟基黄酮抑菌分析 六羟基黄酮的抑菌能力主要由其化学结构决定，黄酮芳环上羟基的化学结构位置和其个数直接影响其抑菌活性。黄酮类化合物的抗菌活性主要体现在破坏细菌细胞膜、减缓菌体能量代谢及降低细菌的致病性等（柯春林等，2015；杨彩霞，2014）。它的抑制菌能力与其膜交互作用有紧密的联系（吴婷，2014）。黄酮可以通过羟基破环细菌的细胞膜，使其营养物质流失（侯媛媛，2015）。同时，还可以抑制细菌DNA拓扑异构酶，导致其体内某些蛋白和酶表达量的下降，引起菌体多种生物学功能的丧失，从而抑制菌体的生长和繁殖（陈禹先等，2013）。

研究证实，某些黄酮抑制细菌效果良好。张洺嘉等（2018）研究发现，黄酮能阻碍细菌细胞膜的形成；Basile等（1999）研究结果显示，黄酮类化合物对奇异变形菌MIC为0.016 mg/mL；赵香汝等（2010）采用纸片扩散法测定了多种中药对奇异变形菌及其他细菌的抑制效果，其中黄芩对奇异变形菌的抑菌圈为8 mm，MIC为7.8 mg/mL。而本研究的数据显示，六羟基黄酮浓度为0.1 mg/mL时有抑制细菌效果，抑制细菌圈的直径为13.36 mm，MIC为0.125 mg/mL，与上述研究结果相似。付璟等（2014）采用滤纸片法得出，六羟基黄酮对大肠杆菌的MIC为0.3125 mg/mL。本试验得出的结果显示，对大肠杆菌的抑制效果在浓度为100 mg/mL时最佳，抑制菌圈直径为19.80 mm，MIC为0.625 mg/mL。这与上述结果存在一定差异，可能是由于本试验所采用的六羟基黄酮纯度与其他试验不一致，同时，牛津杯法与滤纸片法存在一定差异。

云宝仪等（2013）用牛津杯法探究黄芩素对MRSA的抑制能力，其抑菌圈直径达到16 mm，MIC为0.04 mg/mL。张有志等（2014）采用牛津杯法研究黄芩醇提取物对金黄葡萄球菌的抑制活性发现，150、200、250、300 μg/μL时抑菌圈直径分别为17、18、18、18 mm。而本试验结果是在浓度为100 mg/mL时，抑制效果最佳，抑制细菌圈约为16.64 mm，不论是浓度增大还是浓度降低，抑菌效果都会变弱。本试验结果与上述结果大体相似。但达到同样的抑菌效果，本试验的供试药液需要更高的浓度，这可能是因为所使用的菌种型号和所用的供试药液的纯度不同而导致的差异。

张霖等（2011）采用了体外药敏试验，得出黄酮对于鼠伤寒沙门菌的抑制细菌圈直径为11 mm。侯媛媛等（2015）研究表明，黄芩素在10 mg/mL时，对沙门氏菌的抑制细菌圈直径为14.6 mm左右，MIC为1 mg/mL。本试验中，六羟基黄酮MIC为2.5 mg/mL。与上述结论相似，但同样浓度的抑制效果有所差异，这可能是六羟基黄酮的抗菌成分提取方式不同导致抗菌成分含量不一致，从而导致抑菌效果有所差异。

3.2 六羟基黄酮抗氧化分析 六羟基黄酮抗氧化的内在机理是提供一个或多个氢原子，与脂类有机化合物的自由基相结合，转变成酚基自由基，从而降低了氧化速度（岳庆磊等，2003）。李志等（2019）研究结果表明，薏苡仁总黄酮与DPPH清除率之间呈现出正相关关系。本试验中，六羟基黄酮对·OH和DPPH有较强的清除作用。在2.00～4.50 mL（浓度梯度0.03～0.26 mg/mL）时，六羟基黄酮对·OH的清除效果随含量升高而变强，最后逐渐稳定；六羟基黄酮对·OH的清除作用虽略小于VC，但差值在10%之内。六羟基黄酮对DPPH的清除能力也随含量升高而变大，与上述结果相似。六羟基黄酮虽略比VC的清除率低，但在样品量为4.8～6.0 mL（浓度梯度0.11～0.14 mg/mL）时，六羟基黄酮抗氧化性略强于VC。可以认为六羟基黄酮具有非常强的抗氧化效果。

4 结论

六羟基黄酮对4种有害菌均有较强的抑菌能力，浓度为100 mg/mL时效果最好。六羟基黄酮对·OH、DPPH的最大清除率分别为86.67%、96.69%，总体抗氧化性水平与维生素C接近。