贵州地区青贮饲料中天然乳酸菌分离鉴定及优良菌株筛选

付 浩， 金 晶， 朱 欣， 李龙兴*

（1.贵州省草地技术试验推广站，贵州贵阳550006；2.贵州大学生命科学院，贵州贵阳550025）

近年来，随着生态畜牧业的快速发展，青贮饲料作为发展畜牧业的重要手段之一，越来越受到人们的重视（万志涛，2020）。青贮饲料的品质取决于青贮自然发酵过程，在厌氧条件下，同型乳酸菌可产生有机酸等代谢产物，有效抑制有害微生物的生长，同时赋予物料良好的风味和质地（温雅俐等，2010），经发酵后的饲料变得松软，具有芳香的酸味，适口性好，能增强牲畜的食欲，促进动物的消化吸收（汪文忠，2017）。

青贮饲料主要通过原料上附着的乳酸菌等微生物发酵得来，在发酵过程中，除了乳酸菌以外，还有其他多种微生物参与发酵过程，包括促进发酵的微生物以及引起青贮腐烂的微生物，且不同地区微生物种类、数量也相差甚大，形成一个极其复杂的微生物共生体系（张大伟等，2007）。在青贮发酵过程中，微生物菌落的结构和丰度是动态变化的，其中乳酸菌等少数优势菌种对整个种群变化起关键作用（杨文琦等，2013）。

目前，对青贮饲料中天然乳酸菌的筛选和应用的研究报道较多（崔棹茗等，2015），通过分离得到的优势乳酸菌应用到青贮饲料中，不仅可以改善青贮饲料品质，还可以显著提高青贮有氧稳定性。但有研究发现，受到区域性环境因素的影响，在西藏地区添加商品用乳酸菌制剂未能较好地改善青贮饲料发酵品质（王奇等，2015）。因此，掌握原料中乳酸菌群落结构特征和筛选适宜本地区的优势乳酸菌是改善该地区青贮饲料发展品质的关键。本研究拟对贵州地区青贮饲料中乳酸菌组成进行系统分析，筛选出优势乳酸菌，掌握其生物学特征，为本地区的乳酸菌资源在青贮饲料中的应用提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料 青贮原料主要为全株青贮玉米，均来自于贵州不同种植区域，在乳熟期收割后立即青贮发酵。样品在原地切碎后装入青贮真空袋密封，每个样品2个重复，带回实验室发酵两个月后取样。

1.2 乳酸菌菌株的分离 称取发酵后的青贮饲料10 g放入150 mL广口锥形瓶中，并加入90 mL无菌生理盐水，密封，放入转速为120 r/min的摇床上，摇动2 h后，添加无菌生理盐水进行适当稀释，选取3个适宜梯度涂板GYP平板培养基，每个梯度设置2个平行，37℃下培养20～24 h，从中分离挑选出200株具有黄色透明环的菌株，接种到MRS平板培养基上划线培养，30℃培养2～3 d，再挑选出单株菌落重复划线培养2次，从而筛选得到纯化的单菌株。

1.3 乳酸菌菌株的形态学鉴定 根据单株菌落的大小、颜色、光泽、形状等，选取具有典型的菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。将初步判定为乳酸菌的菌株接种到MRS液体培养基中，在30℃培养24 h后，加入等体积的甘油（40%），-20℃保存。

1.4 菌株16S rRNA序列测定及系统进化树的构建 按照PCR扩增细菌16S rRNA试剂盒说明进行操作（试剂盒购自TaKaRa公司），将初步判定的乳酸菌接种到MRS液体培养基中，30℃培养12 h后，取培养液各1 mL，在13000 r/min条件下离心10 min，弃上清，沉淀用于DNA提取（Cai等，1998）。PCR选用细菌16S rRNA V3区通用 引 物，27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492r：5'-TACCTTGTTACGACT-3'。PCR反应体系：2×PCR Master Mix 25 μL，引物各2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。反应产物的纯化按照胶回收试剂盒说明进行操作。用NCBI提供的Blast将所测定菌株的16S rRNA序列与Gen-Bank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的16S rRNA序列进行比对，查找与测定的基因序列同源性最高的菌种，分析相似性，通过邻近法构建系统发育树（李志忠等，2017；任海伟，2015）。

1.5 乳酸菌筛选及生理生化特征测定 将175株乳酸菌分别接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养，培养12 h和24 h时测定菌液的OD值和乳酸浓度，筛选出生长速度快、乳酸产量高的10株乳酸菌（DF-12、DF-20、QZ-35、DS-45、DS-69、DS-71、FG-77、FG-85、RH-135和HP-166），其中乳酸浓度利用SBA-40X三通道生物传感分析仪进行测定（任海伟等，2016）。对10株筛选出的乳酸菌进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验和生理生化特征检测（Higgins等，1994；Nei等，1987）。糖发酵试验按照试剂盒说明进行操作（试剂盒购自青岛海博生物技术有限公司）。

1.6 优势乳酸菌生长曲线和产酸速率的测定将进一步筛选出的10株乳酸菌分别接种到MRS液体培养基中，37℃条件下培养，每隔4 h测其OD值和培养液pH，分别绘制出乳酸菌生长曲线和产酸速率曲线（Cai等，1998）。

1.7 耐酸、耐温乳酸菌的筛选 将优势乳酸菌分别接入不同pH（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5）和不同温度（20、30、40、45、50℃）的MRS液体培养基中，连续培养24 h后测定各组发酵液的OD值和乳酸浓度。

2 结果

2.1 青绿秸秆中乳酸菌群落结构特征 在每组样品的GYP培养基上随机挑选出具有黄色透明环的20株菌株，共收集到菌株200株，其中呈现革兰氏染色阳性和过氧化氢酶阴性的菌株有175株。对175株菌株序列测定结果经NCBI Blast N进行序列比对，分别有88株植物乳杆菌（L.plantarum），占乳酸菌总数50.3%；35株短乳杆菌（L.brevis），占比20%；22株副干酪乳杆菌（L.paracasei），占比12.6%；10株鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus），占比5.7%；8株戊糖片球菌（P.pentosaceus），占比4.6%；7株布氏乳杆菌（L.buchneri），占比4%；5株罗斯乳杆菌（L.rossiae），占比2.9%。

2.2 乳酸菌的生理生化特征 通过初步筛选出生长速度快、乳酸产量高的10株乳酸菌的生理生化特征见表1。初步判定菌株DS-71和RH-135为片球菌属（Pediococcus），其他菌株为乳杆菌属（Lactobacillus）（李志忠等，2017）。10株菌株中，QZ-35、DS-69、FG-85和HP-166均能消耗葡萄糖产生乳酸和气体，表明它们是异型发酵乳酸菌，其余6株菌株为同型乳酸菌。

表1 乳酸菌的生理生化特征

通过糖发酵试验结果表明（表2），DF-12能较好的利用葡萄糖产生乳酸，且能发酵半乳糖、乳糖、甘露醇、七叶苷、纤维二糖、水杨苷、蔗糖、果糖、甘露糖、蜜二糖、山梨醇，可初步认定为副干酪乳杆菌（L.paracasei）（于佳弘等，2017）；DF-20、DS-45、FG-77能利用除木糖、山梨醇、菊糖、马尿酸和鼠李糖外的其他糖进行发酵，初步认定为植物乳杆菌（L.plantarum）（Pang等，2017）；QZ-35能发酵利用半乳糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、果糖、阿拉伯糖和蜜二糖，且为杆菌，初步认定为类布氏乳杆菌（L.parabuchneri）（陶雅等，2017）；DS-69、FG-85能利用半乳糖、阿拉伯糖、果糖、蜜二糖进行发酵，不能利用其他糖发酵，初步认定为短乳杆菌（L.brevis）（李志忠等，2017）；DS-71、RH-135可以利用半乳糖、七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、水杨苷、阿拉伯糖、果糖、甘露糖进行发酵，且为球菌，初步认定为戊糖片球菌（P.pentosaceus）（陶雅等，2017）；HP-166不能利用乳糖、木糖、棉子糖、蜜二糖进行发酵，初步认定为鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）（关皓等，2017）。

表2 糖发酵试验结果

2.3 乳酸菌的16S rDNA系统发育树构建 通过构建10株乳酸菌的系统发育树（图1），菌株DF-12与L.paracasei相似度达99%，可鉴定为副干酪乳杆菌；菌株DF-20、DS-45和FG-77与L.plantarum以97%的相似度聚在一支上，可鉴定为植物乳杆菌；菌株QZ-35与L.parabuchneri的亲缘关系比其他菌株近，可鉴定为类布氏乳杆菌；DS-69、FG-85与L.brevis以98%的相似度聚在一支上，可鉴定为短乳杆菌；DS-71、RH-135与P.pentosaceus的亲缘关系比其他菌株近，可鉴定为戊糖片球菌；HP-166与L.rhamnosus的相似性达99%，可鉴定为鼠李糖乳杆菌。

图1 基于16S rRNA基因序列构建的乳酸菌系统发育树

2.4 10株分离乳酸菌生长特性研究 菌株DF-20、DS-69、RH-135和HP-166生长趋势基本一致（图2），12～20 h为对数生长期，发酵24 h后菌株进入稳定生长期。菌株QZ-35、DS-45和DS-71生长速率较慢，20～32 h才进入对数生长期，40 h后有衰退现象。

图2 10株乳酸菌的生长曲线

10株乳酸菌在37℃下培养下，其pH变化如图3所示，所有菌株的初始pH均从6.2开始总体呈下降的趋势，在3.6～4.0达到稳定状态，在培养12 h后整体下降的速率最快，32 h后基本上进入稳定时期，其中DF-20、DS-69、FG-85、RH-135和HP-166产酸速率最快，36 h左右pH达到3.6。结合菌株的生长趋势，初步筛选菌株DF-20、DS-69、RH-135和HP-166作为优势菌株用于进一步的研究。

图3 10株乳酸菌的产酸曲线

2.5 优良乳酸菌耐温性比较 进一步筛选后的4株优良乳酸菌在不同温度条件下培养的生长情况如图4，整体上，菌株在30～45℃的培养条件下生长情况较好，乳酸产量较高（图5），其中生长速率最快的是在30℃条件下培养的HP-166菌株，乳酸产量最高的是在45℃条件下培养的RH-135菌株，达到2314 mg/L；在50℃时4株菌株生长速率较低、乳酸产量也较低，可见高温（50℃）不利于这4株菌株的生长和乳酸的生成；在20℃时生长速率较快，但乳酸产量较低，说明低温（20℃）不利于乳酸的生成。4株菌株中，总体上菌株DS-69、RH-135和HP166生长速率较快，乳酸产量也较高，初步判断菌株DS-69、RH-135和HP166具有一定的耐高温生长特性。

图4 乳酸菌在不同温度时的OD值

图5 乳酸菌在不同温度时的乳酸浓度

2.6 优良乳酸菌耐酸性比较4株筛选出来的优良乳酸菌在不同初始pH条件下的生长和乳酸积累情况如图6和图7所示，在pH低于3.5培养条件下，菌株OD值和乳酸产量较低，说明不适合菌株生长繁殖；pH在4.5～7.5，菌株生长速率较快，乳酸产量高，其中pH为6.5时最适合菌株的生长繁殖。4株菌株中，菌株DS-69和RH-135生长速率较快，乳酸产量最高，其中乳酸含量最高的为菌株DS-69，达到1920 mg/L。结合4株乳酸菌的耐温性，菌株DS-69和RH-135更具有一定的耐温性和耐酸性，乳酸生成能力强。

图6 乳酸菌在不同初始pH时的OD值

图7 乳酸菌在不同初始pH时的乳酸浓度

3 讨论

青贮发酵过程中有多种微生物参与，受青贮原料来源、环境温度、发酵生化反应过程的影响，微生物群落组成结构和数量存在着较大的差异（关皓等，2019；黄峰等，2019；陶雅等，2017；Si等，2012）。崔棹茗等（2015）从青藏高原地区种植的青稞秸秆发酵的青贮饲料中分离出乳酸片球菌、戊糖片球菌、植物乳杆菌等4种生长速率快、耐低温、产酸能力强的乳酸菌。关皓等（2019）从西南高温高湿地区青贮饲料中分离出8种乳酸菌，从中筛选出4株生长速率快、耐温耐酸耐盐性好、产酸能力强的菌株，其中包括唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等异型发酵乳酸菌。李志忠等（2017）从玉米秸秆和白菜尾菜混贮料中分离出乳杆菌属和片球菌属的12株乳酸菌，从中筛选出2株产酸能力强、耐酸碱、耐高温特性的菌株。Pang等（2011）从玉米秸秆发酵的青贮饲料中分离得到短乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌等6种乳酸菌。本研究从全株玉米青贮饲料中分离出175株乳酸菌，通过菌株序列测定有7种乳酸菌，其中植物乳杆菌为主要菌种，与已报道的结果基本一致（关皓等，2019），分离出的鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌也广泛存在于贵州地区的玉米秸秆青贮中（关皓等，2019；董祥，2019）。尽管在蔬菜、面团等里面分离出过罗斯乳杆菌（L.rossiae）（Rio等，2018；De等，2014），但在发酵秸秆青贮饲料中尚未广泛报道。

青贮在发酵过程中，青贮原料附带的微生物特别是乳酸菌利用水溶性碳水化合物能快速的生长繁殖，不断产生有机酸，从而导致饲料酸化，抑制有害微生物的生长（关皓等，2019）。因而，青贮饲料中乳酸菌的繁殖速率和产酸能力是青贮发酵成功的关键因素。具有高活性和产酸能力强的乳酸菌不仅能缩短青贮发酵周期，还能改善青贮营养品质（李志忠等，2017）。在实践中，常通过添加商用乳酸菌制剂等青贮添加剂来促进青贮发酵进程，提升青贮品质（张庆等，2019），因此筛选本土适应性强、生长速率快、产酸能力强的乳酸菌很有必要。本研究中从青贮饲料中初筛得到10株生长速度较快、乳酸产量较高的乳酸菌，整体上在培养12～20 h处于对数生长期，24 h后进入稳定生长期；有机酸含量在培养12 h时开始大量积累，发酵液最低pH达到3.6，这与于佳弘等（2015）从玉米青贮中分离出的乳酸菌试验结果基本一致。

本试验中，与其他菌株相比，菌株DF-20、DS-69、RH-135和HP-166表现出了生长速率更快、产酸能力更强的特性，通过耐温性试验，在45℃及以下的培养条件下，4株菌都有良好的生长繁殖速率和乳酸积累量，说明4株菌具有较好的温度适应性。青贮饲料发酵过程中，内部温度可高达40℃，普通菌株生长受限（Bernardes等，2018；Gulfama等，2017；Chen等，2013）。因此，建议在温度较高地区使用耐温乳酸菌作为青贮发酵添加剂（张庆等，2019），以此提高青贮发酵品质。在耐酸性试验中，4株菌都能在初始pH为4.5的环境中较好的生长和乳酸积累，但不同菌株的生长速率和乳酸产量表现出差异性，这与李雪莉等（2017）对筛选获得的乳酸菌进行耐酸试验，发现菌株间的耐酸性差异结果相似。

根据本研究的耐温性耐酸性试验，DS-69和RH-135菌株具有较强的繁殖速率和产酸能力，与McDonald等（1991）研究提出的理想青贮用乳酸菌添加剂一致。因此，建议结合DS-69和RH-135菌株的特性，将其制成复合乳酸菌剂应用于高温地区青贮饲料发酵使用。

4 结论

从玉米秸秆和酒用高粱秸秆混合青贮饲料中共分离出175株乳酸菌，通过16S rRNA测序测定有7种乳酸菌，其中植物乳杆菌为主要菌种，其余为短乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、戊糖片球菌、布氏乳杆菌，以及较少报道的罗斯乳杆菌（L.rossiae）。从中筛选出4株生长速率快、产酸能力强的乳酸菌，分别为植物乳杆菌（DF-20）、短乳杆菌（DS-69）、戊糖片球菌（RH-135）和鼠李糖乳杆菌（HP-166），耐温耐酸试验证明，DS-69和RH-135具有较强的高温适应性和酸性环境适应性，且产酸能力强，可作为良好的青贮用乳酸菌添加剂应用于实践生产中。