野慈姑(Sagittaria trifolia)人工授粉的有效性：授粉工具与花粉保存

解季明,丁新颖,张宇杰,汪正祥,3,戴 璨,3,*

1 湖北大学资源环境学院, 武汉 430062 2 湖北大学生命科学学院, 武汉 430062 3 区域开发与环境响应湖北省重点试验室, 武汉 430062

人工授粉是一项能够解决诸多农业生产问题以及促进科学研究的关键性技术。一方面,它能够有效提高授粉成功率、座果率以及果实质量,避免不利的自然因素,保证农作物的经济价值[1- 3]。例如蓝莓[4]、可可[5]、椰枣[6]等作物均依赖人工授粉获取较高的产量和经济效益。另一方面,它也为研究人员探究植物繁育特征、交配系统以及传粉互作等科学问题提供了一种行之有效的手段[7-14]。同时,人工授粉技术还有具有操作便捷的特点：将前期收集的新鲜花粉(花药)置于存储容器中,并通过毛刷、棉签、镊子或特制授粉工具将花粉多次轻柔缓慢地涂抹于柱头之上便可完成授粉。因此,人工授粉技术一经推出,便迅速应用于诸多领域。

虽然人工授粉的方法一直被广泛采用,但是一项综述研究指出该方法背后的基础问题很少被关注,试验验证更是凤毛麟角[15]。其中之一即为花粉从活体植物取下后授粉前的保存问题,因为花粉的储存环境对于人工授粉而言至关重要,不利的温度以及较长的时间均可能会快速降低花粉活性,进而对试验结果产生干扰。已有部分文献报道了某些物种花粉的长期保存技术与条件,低温保存似乎是一个良好的方式,能够有效维持花粉活性处于较高水平,但具体的储藏温度取决于物种特性。比如,Abreu和Oliveira[16]将猕猴桃(Actinidiadeliciosa)花粉置于不同温度下进行储藏,发现-20℃条件下储藏54周的花粉活性和萌发率均高于20℃、-80℃、-196℃处理。Maryam等[17]也指出-20℃是椰枣(Phoenixdactylifera)花粉的最佳储藏温度。但Bhat等[18]在三种梨属(Pyrusspp.)栽培种的储藏试验中发现-196℃下萌发率最高。上述研究均显示出温度对于花粉的活性具有一定的影响。令人遗憾的是,虽然Stone等人的综述已经发表了20余年,但近些年的人工授粉试验似乎在离体花粉保存条件方面并没有明显的提及[19-21]。大多数研究仅模糊表述采用“新鲜”花粉,也没有试验验证花粉的储藏条件是否影响花粉的活性、可用性[22-24]。

为了达到定性或定量授粉的目的,人工授粉时常常借助毛刷等工具混合和涂抹花粉。相较于直接用雄花(花药)接触雌蕊授粉,毛刷授粉还具有授粉均匀、操作便利、标准统一等优势,一直以来被普遍采用[25-30]。或许是应用广泛且效果良好(座果结籽得到了保证),几乎所有的试验都默认了工具授粉与其他授粉方法的等效性。然而,已经有不少研究发现使用毛刷进行人工授粉后的座果或结实下降的情况。比如,Matsumoto和Takakura[31]用混合花粉对日本本土蒲公英(Taraxacumjaponicum)进行了人工授粉,其种子数量显著下降。Prokop和Neupauerová[32]报道了田旋花(Convolvulusarvensis)的人工授粉试验组全部结实失败,很可能因不当的授粉操作导致可能。上述试验结果表明借助毛刷等工具的人工授粉在操作过程中可能存在诸多不可控因素对花粉或柱头产生干扰,比如机械损伤、组织表面活性物质的变化、花粉粘稠度的破坏等[33-34]。此外,人工授粉也常常应用于花粉补充以探究植物的繁殖状态[35],理论上补充后的座果结实应该不低于自然状态,但是积累的证据表明补充授粉在一些物种中反而会降低繁殖表现[34,36- 38],从一个侧面暗示了授粉方法本身的弊端。然而,甚少文献直接关注人工授粉方法对繁殖的影响,如果工具授粉对植物产生了负面作用,相关结论的科学性则会大打折扣。

本文以多年生挺水植物野慈姑(Sagittariatrifolia)作为试验材料,通过两年的人工授粉试验,比较了授粉方式、花粉处置以及花粉离体时间对于植物繁殖的影响,试图解决如下问题：(1)借助毛刷工具的人工授粉是否影响野慈姑的结实？(2)花粉的处置温度和离体时间如何影响野慈姑的结实？

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验于湖北省武汉市的中国科学院武汉植物园(114°25′18″E, 30°32′36″N)内进行。在园内选取了一块高约1m的露天台地作为同质园区,周围无高大建筑物遮挡。野慈姑植株是2013年在湖北省22个自然种群采集的球茎克隆后代[39-40],共计58个基因型,258盆植株。

1.2 试验材料

野慈姑 (SagittariatrifoliaL.) 隶属于泽泻科慈姑属,是一种生长在池塘、沼泽、沟渠、水田等浅水处的多年生草本植物[41]。其繁育系统为雌雄异花同株,总状花序,每轮一般三朵花,自下而上顺次开放。花序基部为雌花,开放持续1—2d,顶部为雄花,开放持续4—10d,但单花花期均为1d。雌雄花部结构基本相同,都有三瓣白色花瓣,具花蜜。雌花中央的绿色球状物为心皮,其多心皮离生,在头状花托上紧密分布,每个心皮具一个细小的花柱。雌花在授粉后20d左右发育为成熟的球形聚合瘦果。野慈姑依赖虫媒传粉,食蚜蝇、小型蜂类等多种昆虫可为其传粉[39]。植物花期从6月开始,大约持续至10月结束(湖北地区的盛花期为7—8月)。野慈姑自交亲和、兼有有性繁殖(开花结实)和无性繁殖(地下球茎)。

1.3 试验设计

1.3.12018年试验

为了比较授粉方式是否影响野慈姑结实的数量与质量,试验设计了硬毛刷授粉与接触授粉两种授粉方式。人工授粉方面,采用小排笔(美术用)给雌花授粉,花粉来源于整个同质园当日开放的所有雄花,每个植株至多取2朵雄花,将花药放入塑料杯中混合均匀,用毛刷蘸取混合花粉,动作柔缓地涂抹在雌花的球形心皮上,直至均匀饱和。接触授粉方面,由于直接用雄花的花药与心皮接触,不易控制授粉量,往往一两朵雄花接触后即达到饱和状态。故授粉时选取与雌花植株种群来源相同或相近的两个基因型的2朵雄花进行授粉(模拟自然异交状态)[42]。为了避免昆虫造成传粉污染,严格在授粉前后对雌花进行套袋处理,并于人工授粉第二日将套袋摘除(雌花已不具备可授性),以免影响果实发育。

该试验于2018年8月进行,共计完成硬毛刷授粉38朵花,接触授粉52朵花。为防止果实成熟后散落,于授粉处理10d后对已发育的果实进行套袋。待果实成熟后(颜色变为褐色、紧致变为疏松状态),采摘并置于牛皮袋中,每个袋中仅存放一个果实。

1.3.22019年试验

为了细致比较毛刷授粉的副作用,授粉方式相较于2018年试验增加至3种,即直接接触授粉、软毛刷授粉、硬毛刷授粉。其中硬毛刷授粉与2018年相同,采用小排笔,而软毛刷授粉选用软质眼影刷。二者刷毛质地的区别在于当前者接触心皮授粉时,刷毛不会弯曲,而后者授粉时刷毛弯曲。接触授粉方法与2018年相同,只是在雄花来源上为了尽量与毛刷授粉保持一致,随机从整个同质园的植株中摘取。毛刷授粉方面,在2018年的基础上,也限定了每杯混合花粉授粉雌花的上限,使得平均每朵雌花对应的雄花数量与接触授粉相当。这些授粉细节的改进是为了更严格的控制花粉来源与授粉量,保证直接接触和毛刷介质是几种授粉方式的唯一区别。

本试验还设计了第二个方面的控制,即授粉前的花粉处置。处理分为对照、低温保存、高温保存3个水平。低温方面,将收集的雄花或混合花药放入装有冰盒的保温冷藏箱内,储存期间箱内温度维持在5℃。冰盒沿冷藏箱边缘放置,中间预留足量空间,以避免花粉与冰盒直接接触。高温方面,将收集的雄花或混合花药塑料杯直接置于野外阳光直射处,储存温度随每日天气略有浮动,为(43.0±2.9)℃。花粉于低温或高温保存30min后取出,采用直接接触、软毛刷或硬毛刷授粉。对照是将雄花或花药从活体植物上摘下(混合)后,立即完成相应的授粉。

授粉方法与花粉处置两个因素组合成了阶乘设计,共计3×3=9种不同的处理。此外,为了进一步探究花粉活性的持续时间,还添加了一种低温处置90min后软毛刷授粉的处理。以上共计十种处理,每种处理重复约50个样本(基因型)。为了控制母体效应,所有处理尽量在同一花序的不同雌花上完成且位置随机。该试验于2019年8月进行,花朵的套袋、果实的采集与处理方法与2018年相同。

1.3.3繁殖指标

采用座果概率、单果种子数量、种子大小、萌发率、幼苗芽长5个指标衡量野慈姑在不同授粉处理下的繁殖水平。其中,雌花若座果成功记为1,失败记为0。果实采集回试验室后,用解剖针与镊子将果实内的所有种子平铺于白色纸板上,保证种子之间不重叠。固定相机(尼康D7000)位置与焦距,垂直拍摄白色纸板,将图片导入电脑,并使用软件Image J统计单果种子数量与种子大小[37]。

在种子计数完成后,随机从每个果实中选取100粒种子置于装有自来水的塑料杯中,放入人工气候箱(MGC- 350HP- 2,一恒,上海)中进行萌发培养。设定气候箱内的温度为30℃、相对湿度20%、光照时间18h、光照强度设定为最大值(20000lm)。待培养10d后,统计萌发率(出芽个数%)并测量最长的幼苗芽长(cm)。因2018年的分析显示授粉方式对种子的萌发率、幼苗芽长均无影响(见结果),故2019年未进行萌发试验。

1.4 数据处理

2018年的试验采用单因素的方差分析,分别对座果概率、单果种子数量、种子大小,萌发率和幼苗芽长进行统计,其中座果概率采用二元分布的广义线性模型(proc glimmix,dist=binary),其他变量为混合线性模型(proc mixed),所有模型中的固定因素为授粉方式,随机因素为试验日期,萌发率和幼苗芽长添加了萌发温箱为随机因素。

2019年的试验采用二因素的方差分析,固定因素为授粉方式与花粉处置,两者的交互作用所有模型均不显著,故删去。响应变量有座果概率、单果种子数与种子大小,其中座果概率采用二元分布的广义线性模型(proc glimmix,dist=binary),其他变量为混合线性模型(proc mixed),所有模型中的随机因素包括试验日期和花朵轮次。此外,对低温保存90min处理的结果,由于其采用软毛刷授粉,将所有软毛刷的处理集合,保证单一的授粉方式,单独分析了花粉处置对座果结实的影响,模型同上。

本试验的统计使用SAS 9.2软件,在方差分析之前检测了所有连续变量的正态性。其中,2018年的单果种子数与萌发率正态性较差,对单果种子数进行了开方转换,萌发率进行了开方后反正弦转换,其他变量直接使用原始数据。转换后,所有连续变量的方差同质性均满足。结果和图表中均使用算术平均数±标准误差。

2 结果与分析

2.1 授粉方式对野慈姑繁殖的影响

两年的试验均显示出授粉方式对野慈姑的座果概率和单果种子数量产生了显著影响(图1、图2)。与毛刷授粉相比,用雄花直接接触的授粉方式达到了更高的座果(2018年：F1,80=6.22,P=0.015；2019年：F2,436=10.34,P<0.0001)和种子数(2018年：F1,59=41.07,P<0.0001；2019年：F2,342=8.78,P=0.0002)。不过,软硬两种毛刷质地对座果和种子数的不利影响并没有显著差异。由图2和表1可知,授粉方式之间的种子大小(2018年表1；2019年：F2,342=1.14,P=0.32)、萌发率以及幼苗芽长均无显著差异,这说明毛刷授粉对野慈姑的种子质量影响不大。

表1 2018年野慈姑在两种授粉方式下的种子大小与萌发情况

图1 2018年野慈姑在两种授粉方式下的结实情况Fig.1 Fruiting status of Sagittaria trifolia under two methods of pollination in 2018图条上方*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.0001

2.2 花粉处置对野慈姑繁殖的影响

花粉的处置方法对座果概率产生了显著影响(F2,436= 4.59,P=0.011),其中,经过高温保存的座果概率显著高于对照组(图2)。不过,处置水平之间的单果种子数量(F2,342=0.86,P=0.42；图2)和种子大小无显著差异(F2,342=0.48,P=0.62；图2)。此外,低温保存90min的花粉授粉后座果概率为(71±7)%,单果种子数为111.77±11.90,种子大小为(6.43±0.19)mm2。3个指标均与其他花粉处置条件差异不显著(座果概率：F3,182=1.63,P=0.18；单果种子数：F3,126=1.24,P=0.30；种子大小：F3,126=0.68,P=0.56),暗示90min的低温存放不会影响野慈姑的花粉活性。

图 2 2019年野慈姑在不同授粉方式和花粉处置下的繁殖情况Fig.2 Reproductive performance of Sagittaria trifolia under different methods of pollination and pollen handling in 2019图条上方不同字母表示各处理间差异显著(P<0.05)

3 讨论

根据两年的试验结果,授粉方式均显著影响野慈姑的座果概率和单果种子数量(图1、图2),毛刷授粉操作对野慈姑的繁殖产生了负面影响。这一结果虽看似略显意外,特别是考虑到毛刷授粉的广泛采用、对繁殖的负面影响应该很小,但连续两年的独立试验结果非常一致,都指出毛刷作为一种授粉工具确实降低了野慈姑的繁殖水平。相较于接触授粉,硬毛刷授粉使得2018年的座果概率和单果种子数量分别下降了30%和67%,2019年的座果概率和单果种子数分别下降了17%和13%。可能的一个原因是：相较于花药与柱头的接触,毛刷授粉也许对植株的花粉或柱头造成了物理损伤[34,37]。考虑到自然状态下,野慈姑的花粉附着在蜜蜂、食蚜蝇等昆虫的腹部或腿部刚毛处,接触可能更加柔和。不过,第二年的试验增加了软毛刷的处理,其结果显示座果概率和单果种子数分别下降了19%和25%,这表明无论毛刷质地如何,毛刷授粉这一操作均对野慈姑的座果结实存在消极影响。软硬两种毛刷质地之间的繁殖表现并无明显差异,这可能与野慈姑特殊的心皮结构有关,其多心皮离生,在头状花托上紧密分布,每个心皮都会伸出一个花柱,其柱头细小脆弱,排列于心皮顶端[43-44]。相较于其他物种结实有力的大型花柱,如此敏感短小的花柱更容易因物理摩擦而受到损伤,不论毛刷的软硬程度。当然,由于这种心皮结构的存在,每个小柱头上不均匀的花粉落置也可能导致有些柱头被饱和授粉而有些柱头的花粉缺失,造成了局部的花粉限制进而导致座果结实的下降[44]。以上提到的方面在今后的试验中可以通过授粉后立即镜检的方式进一步研究。此外,毛刷也可能对花粉的授精能力造成了一定的影响,如花粉从明显黏合在一起的絮状变为打散的颗粒状,花粉表面的活性物质被毛刷吸附等等。结果还显示,野慈姑经历不同授粉方式后结实的种子大小、萌发率、幼苗芽长均保持稳定,表明种子质量不受毛刷的影响。多则研究表明野慈姑的种子大小在不同物理和授粉环境下较为稳定[39,45],说明其种子质量不同于数量,可能更多受到固有发育机制的调控。

不同花粉处置条件下,野慈姑的座果概率出现了显著差异。高温保存的花粉造成的座果率较高,这可能与高温促进了花粉活性有关。虽然已有部分研究报道了高温对花粉活性以及后续繁殖表现具有一定的负面影响[46-50],但Bajaj等[51]指出经历高温处理的烟草花粉后代表现优于未经历高温处理的,这与本试验结果基本吻合。极端的试验高温确实会降低花粉活性,甚至导致花粉的死亡。但本试验的高温处理是在环境高温下增加了花粉在野外的离体时间,并没有将花粉置于非自然的极端高温。由于野慈姑依赖虫媒传粉,当花粉附着于昆虫体表时,便可以认为花粉处于离体状态。考虑到昆虫在花间的飞行很不规律,短则几分钟之内便可完成授粉,长则甚至几小时。若花粉活性短时间内快速失活,那么虫媒传粉的进化意义将大打折扣。因此,本试验半小时的高温处理证明了野外常规高温并不会对离体的野慈姑花粉活性造成影响。相反,这样的处置还提高了花粉表现,这可能因为试验中花粉采摘的时间较早,温度在一定时间的积累使得野慈姑花粉的酶活性达到一个较高水平[19,52]。同时,柱头的可授性也可能因为温度的积累而升高。90min的低温保存结果暗示野慈姑的花粉活性短时间内不易损失,这可能与其虫媒传粉的特性有关。本试验结果指出,野慈姑的人工授粉试验可以在野外温度下常规进行,其花粉离体后半小时内不需要特殊的处置就能保持甚而促进较高的活性。

4 结论

综上所述,在进行人工授粉的操作中,授粉方式和花粉处置均会对野慈姑的繁殖产生影响,在试验中采下花粉后可直接置于环境温度短时间保存,授粉时尽量避免使用工具、采用雄花(花药)与柱头直接接触的方法。

虽然人工授粉在诸多领域展现出高度的灵活和可控性,但研究人员应警惕授粉工具对授粉效果的影响。在控制对比试验前,应当注意对授粉方式的验证,以确保工具与其他授粉方式的等效性。尤其对于野慈姑这类柱头细小脆弱的物种,更应注意授粉工具对繁殖造成的影响,以保障后续结论的科学有效。同时,还可根据不同类群植物的花药或柱头特性设计开发特定的授粉工具,以更好地完善人工授粉技术。不过,工具授粉也不一定在所有植物中都存在弊端。本试验虽然差异显著,但毛刷授粉的座果概率维持在70%上下,单果种子数在80—100波动,基本保证了中等偏上的繁殖产出。因此,在农业园艺等方面的具体实践中,由于工具授粉的便利高效性十分突出,建议权衡利弊之后采用。