氮磷添加对杉木根叶分解残余物微生物群落结构及酶活性的影响

王玉鑫,付晓莉,王辉民,戴晓琴,寇 亮,方向民

1 中国科学院地理科学与资源研究所生态系统网络观测与模拟重点实验室千烟洲生态站,北京 100101 2 中国科学院大学资源与环境学院,北京 100049 3 江西农业大学林学院,南昌 330045

根、叶凋落物进入土壤后为微生物提供碳源和营养[1],其分解过程共同驱动着生态系统碳排放及养分循环[2]。但根、叶凋落物输入量及分解过程差异巨大。森林生态系统中,根、叶凋落物年输入量之比在0.17—7.83之间[3]。根凋落物分解慢于叶凋落物,且分解至恒定时残余率比叶凋落物高[4]。造成这种差异的原因主要有二方面。一是根叶凋落物化学属性不同。根中相对难分解的碳(C)组分比叶中的高2—3倍,而叶凋落物具有更多易分解的非结构性碳水化合物等C组分[5- 6]。难分解C组分高通常伴有较高的真菌生物量,因为真菌具有分解复杂化合物(如木质素)的酶系统。而易分解C组分则刺激特定细菌生长[7]。二是根叶凋落物分解时所处的微环境不同。叶凋落物累积在土壤表面,更易受降雨的溅蚀与冲刷。根凋落物在土壤内,而大多数真菌(F)分解者需要氧气进行代谢或作为胞外酶的底物,需氧真菌群落在土壤内常受低氧胁迫[8]。值得注意的是,微生物群落结构及胞外酶特征不但参与、影响凋落物分解过程,且可指示生态系统对环境变化的响应与适应性,其本身也具有重要的生态学意义。如,微生物群落结构参数及酶活性比常用来表征养分循环可持续状态[9]、微生物受环境pH胁迫和碳源限制状况[10]、微生物获取养分的投入策略等[11]。

全球尺度的凋落物长期分解试验整合分析表明：凋落物完全分解需要10年以上的时间；分解2年后,针叶林中根、叶凋落物残余率分别约为59%和54%[12]。这些大量的根、叶分解残余物仍是生态系统凋落物层和土壤碳库的重要组成部分,影响着生态系统养分循环过程,且根叶分解残余物间化学属性仍存在显著差异。如,道格拉斯冷杉(Pseudotsugamenziesii)凋落物分解实验表明：分解2年后叶分解残余物中的碳氮比(C/N)、氮磷比(N/P)分别为26和19,而根分解残余物中的C/N、N/P分别为32和16[13]。根叶分解残余物化学属性差异预示着：根叶分解残余物的微生物群落结构、酶活性特征及其对环境变化的响应可能不同。但野外分解试验时布设的初始凋落物质量通常较小(根凋落物为1—2 g,叶凋落物为1—10 g)[6,14- 15],导致分解后期凋落物袋中的残余物质量十分有限,限制了对上述假设的科学验证。

当前,氮、磷沉降是全球变化研究中的重要因子。我国亚热带森林生态系统同时受氮沉降和磷沉降影响[16]。因此,本研究以亚热带地区杉木(Cunninghamialanceolata)林为对象,依托氮磷添加试验平台,布设凋落物分解试验时加大初始凋落物质量,研究了分解3年后根(凋R)、叶残余物(凋L)中的元素含量、化学计量比、微生物群落结构、酶活性,以探究根、叶分解残余物微生物群落结构及酶活性特征对NP添加的响应。我们假设：(1)分解3年后凋R与凋L间养分、微生物群落结构、酶活性仍然存在差异；(2)与受真菌偏好的凋R相比,NP添加对受细菌偏好的凋L中的微生物群落结构及酶活性影响更大,因为生长较慢的真菌比细菌更能抵抗干扰[17]。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

杉木人工林氮磷添加试验平台位于中国科学院千烟洲森林生态系统观测研究站 (115°13′04″E,26°44′52″N,海拔102 m)。该站点主要土壤类型为红壤,属于典型强淋溶土(FAO, 2014),土壤为粉质粘土,pH为4.3[18]。试验区属于中亚热带季风气候,年均气温和降水量分别为17.9℃和1471.2 mm。2011年11月在1998 年种植的二代杉木纯林中建立了氮磷添加试验平台。该平台包括CK(对照)和100 kg hm-2a-1氮+50 kg hm-2a-1磷(NP添加)两个处理,采用完全区组试验设计,每个处理6个样方重复(20 m×20 m)。其中,氮、磷肥分别以NH4NO3和NaH2PO4形式施加,将肥料溶于水,人工均匀喷洒；CK处理人工喷洒等量的水。2011年,样地林龄为14 a,密度约为2137棵/hm2,平均高度约为8.94 m,胸径约为10.3 cm[19]。

1.2 试验设计及样品采集

2012年8月,在CK和NP添加处理中各选取3个样方布设凋落物分解试验。每个样方分别划定2个3×5 m的子样方,去除凋落物层和腐殖质层。并在每个子样方里步设叶凋落物(C含量为463.6 g/kg；N含量为8.4 g/kg；C/N比为55.19)和根凋落物(C含量为468.3 g/kg；N含量为12.8 g/kg；C/N比为36.59)两个处理。其中,叶凋落物处理是将含250 g干重的叶凋落物袋置于PVC管(内径30 cm,长度40 cm)内的土壤表层；根凋落物处理是将含50 g干重的根凋落物袋置于PVC管内土壤的5 cm深处。每种处理有6个PVC管重复。根、叶凋落物均采自未施肥杉木人工林。由于尚未分解的死根很难获取,根凋落物是用0—10cm土层中的活细根(直径≤2 mm)代替。杉木的小枝和叶一起掉落,所以叶凋落物包含小枝。杉木人工林叶凋落物的年输入量约为0—10 cm土层中根凋落物年输入量的5倍[20],因此,叶凋落物干重与根凋落物干重比设置为5∶1。凋落物尼龙网袋尺寸为30 cm×30 cm。杉木叶凋落物、根凋落物的本底化学属性差异显著：根凋落物的N、P、钾(K)、镁(Mg)、铁(Fe)、铝(Al)含量显著高于叶凋落物；但根凋落物的钙(Ca)、锰(Mn)含量显著低于叶凋落物。

于2015年10月(即约分解3年后)采集凋L和凋R。部分样品4℃冰箱保存,部分样品风干,用于后续分析。

1.3 测定方法

采用PLFA法检测微生物群落结构。用i14:0,i15:0,a15:0,i16:0,i17:0,a17:0,16:1ω7cis,16:1ω9cis,17:1ω7cis,18:1w5c,18:1ω7cis,cy17:0,cy19:0表示细菌(B)；18:3ω6cis,18:2ω6cis,18:2ω9cis,18:1ω9cis表示真菌(F)；16:1ω7cis,16:1ω9cis,17:1ω7cis,18:1w5c,18:1ω7cis,cy17:0,cy19:0表示革兰氏阴性菌(G-)；i14:0,i15:0,a15:0,i16:0,i17:0,a17:0表示革兰氏阳性菌(G+)[21]。同时计算环丙基脂肪酸与前体结构的比值(Cy/pre)、单不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值(Mono/sat)[22]、G+/G-及F/B。Cy/pre越大表示微生物受环境pH胁迫越大[10],Mono/sat升高表示微生物受环境碳源限制加剧[11],G+/G-升高表示底物中较难利用的、复杂C组分比例变高[23],F/B升高表示养分循环更可持续、更保守[9]。

根据Allison[24]等人描述的方法测定β-葡萄糖苷酶(βG),N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)和酸性磷酸酶(AP)的活性。酶活性比率(βG/NAG、βG/AP)可代表微生物获取C,N及P的相对投资。βG/NAG较低表明相对于获取C,微生物对获取N的投入更大；βG/AP较低表明相对于获取C,微生物对获取P的投入更大[25]。

全C和全N采用元素分析仪(Vario Max CN,Elementar,Germany)测定。P、K、Ca、Mg、Mn、Fe、Al元素含量使用高压微波消解/萃取仪(ETHOS-T,MILESTONE,Italy)及电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AE,Thermo Elemental,United States)进行测定。

1.4 数据处理与分析

用双因素方差分析(Two-way ANOVA)研究凋落物类型及氮磷添加对分解残余物中微生物群落结构、酶活性及化学性质的影响,并用Bonferroni法对不同处理凋落物间的差异性进行多重比较。用多元逐步回归分析探讨分解残余物中的微生物群落、酶活性参数与化学元素含量及计量比间的关系。上述分析用SPSS statistics 21.0实现,由Origin 2017制图。

2 结果与分析

2.1 分解残余物的化学属性

氮磷添加和凋落物类型对分解残余物化学属性影响显著(表1)。CK处理下,凋R的N、Al含量、N/Ca、N/Mg、N/Mn、P/Ca、P/Mg、P/Mn高于凋L,而Ca、Mn含量低于凋L。氮磷添加对残余物P、Ca含量、C/N、N/P、N/Mn、P/K、P/Ca、P/Mg的主效应显著,氮磷添加显著增大残余物P含量,降低N/P。氮磷添加和凋落物类型对C、P、Ca、Mn含量、N/P、N/Mg、N/Mn、P/Ca存在交互效应。氮磷添加处理下,凋R的N、P、K、Fe、Al、N/Ca、P/Ca、P/Mn含量高于凋L,而凋R的Ca、Mn、C/N、N/Al、P/Al含量低于凋L。

表1 氮磷添加和凋落物类型对分解残余物化学属性(平均值±标准误)影响的方差分析结果

2.2 分解残余物中的微生物群落结构和酶活性特征

凋落物类型对分解残余物微生物群落结构影响显著,氮磷添加对分解残余物微生物群落结构无主效应,凋落物类型和氮磷添加对分解残余物微生物群落结构无交互作用(图1)。总体而言,与凋R相比,凋L中的cy/pre、F/B、G+/G-低,而Mono/sat高。虽然氮磷添加对凋R中的微生物群落结构无影响,但显著提高了凋L中的Cy/pre。

图1 氮磷添加和凋落物类型对分解残余物中微生物群落结构的影响Fig.1 Responses of the microbial community structure in debris to nitrogen and phosphorus additions and litter types图中数据为平均值±标准误(n=6)；CK：对照 Control；NP：氮磷添加 Nitrogen and phosphorus additions；NS：不显著 Not significant；不同字母表示处理间存在显著差异(Bonferroni多重比较检验,P<0.0083)

凋落物类型和氮磷添加均对分解残余物中的微生物酶活性特征有影响,凋落物类型和氮磷添加对分解残余物微生物酶活性特征无交互作用(图2)。凋落物类型对βG、NAG及βG/AP有主效应。与凋R相比,凋L中的βG和NAG活性高,βG/AP大。氮磷添加对AP、βG/NAG及βG/AP有主效应。与CK相比,氮磷添加抑制了AP活性,提高了βG/NAG及βG/AP。其中,氮磷添加对凋R的AP活性抑制作用更强,对凋L的βG/NAG提升幅度更大。

图2 氮磷添加及凋落物类型对分解残余物中水解酶酶活性及酶活性计量的影响Fig.2 Responses of hydrolytic enzymes and related enzymatic stoichiometry in debris to nitrogen and phosphorus additions and litter types图中数据为平均值±标准误(n=6)；不同字母表示处理间存在显著差异(Bonferroni多重比较检验,P<0.0083)

2.3 微生物群落结构和酶活性特征与分解残余物化学属性的关联性

对微生物群落结构参数而言,分解残余物中的Mono/sat、G+/G、F/B分别与分解残余物中Mn含量、P/Ca、N含量正相关(表2)。对酶活性参数而言,分解残余物中的AP、βG/NAG分别与分解残余物N/P、P/Fe正相关；βG/AP、NAG、βG分别与分解残余物N/Mn、P/Mg、N/Ca负相关(表2)。

3 讨论

3.1 根叶分解残余物中微生物群落结构及酶属性差异

凋落物基质质量塑造着微生物群落结构和酶活性特征[26]。C/N是反应凋落物基质质量的典型指标[12]。在C/N高的基质中,微生物往往生长缓慢、酶活性低,但酶系统复杂、效率高[27]。另外基质化学组分会随分解时间发生改变,导致基质中的微生物群落结构及酶活性也随分解时间发生改变[26]。

本研究中,分解3年后凋R与凋L间的微生物群落结构、酶属性仍存在显著差异,且与残余物的化学属性密切相关(表2),这支持了我们的假设一。与凋R相比,凋L的P/Ca和N含量低,导致G+/G-、F/B低；而Mn含量、Mono/sat高(图1)。该结果说明：与凋R相比,尽管凋L中Mn含量高有利于碳的分解[28],但凋L微生物总的碳源限制性高(Mono/sat高)、养分循环可持续性低(F/B低)。此外,凋R微生物受pH胁迫大(Cy/pre高)。这可能是因为：该区土壤为酸性、pH值低,凋R与土壤的接触面积大于凋L,因此受pH胁迫较高[29]；且凋L中Ca元素的富集也有利于缓解pH胁迫[30]。

表2 微生物群落结构及酶活性相关参数与化学性质的多元逐步回归分析

凋L的N/Ca和P/Mg低于凋R(表1),且分解残余物中的βG和NAG分别与N/Ca和P/Mg显著负相关(表2),故凋L的βG和NAG高于凋R(图2)。凋L的βG和NAG高可能与凋L易分解C源比例大(G+/G-低)有关。凋L中的N/Mn低于凋R,且分解残余物中的βG/AP与N/Mn显著负相关,故凋L中的βG/AP高于凋R。此外,酸性胁迫可降低基质中的βG/AP[25],凋L微生物受pH胁迫小也会导致其βG/AP较高。凋L中的βG/AP高说明凋L中的微生物相对于获取P,对获取C的投入更大[31],这与凋L微生物受C限制更大(Mono/sat高)的结果一致。

3.2 氮磷添加对分解残余物中微生物群落结构和酶活性的影响

本研究中,氮磷同时添加对分解残余物中微生物群落结构参数无主效应(图1)。与本研究结果相似,Ma等研究发现NP添加第5年对土壤微生物群落结构无显著影响。微生物群落会随分解阶段而演替[32]。分解初期,对易分解C组分偏好的快速生长的r-策略微生物或共生菌为主导；分解后期,微生物群落逐渐被生长较慢的k-策略微生物取代,这类微生物具有相对复杂高效的酶系统,可以在低营养条件下分解更多的顽固性化合物[33]。可见,分解第3年,根叶残余物中的微生物群落结构渐趋稳定。氮磷添加对微生物群落结构无主效应的原因也可能是由于N、P的激发效应多发生在微生物C限制较低的环境中[34]。此外,采用以碳源利用为基础的BIOLOG微孔板技术或高通量测序技术也许更能细致地发现微生物群落结构与碳源间的关系[35-36],这需进一步探究。

值得注意的是：氮磷添加显著提高了叶残余物的Cy/pre,但未改变根残余物的Cy/pre。这一方面说明氮磷添加增加了叶残余物中微生物的pH胁迫,另一方面也表明根叶残余物所处位置的差异使叶残余物更易受外界干扰影响[37]。

本研究采用50倍于常量的初始凋落物质量,且凋落分解试验需要多次取样,而根系的采集耗时费力。因此,针对研究区存在氮磷同时沉降这一问题,本研究仅解析了NP同时添加对凋落物分解残余物微生物群落及酶活性的影响。未来研究可相对地减少初始分解质量、增设单独氮添加和单独磷添加处理,以期更好地揭示氮、磷外源养分各自输入对凋落物分解残余物生物学特征的影响。

4 结论

杉木林的根叶分解试验表明：分解3年后,凋R与凋L间养分、微生物群落结构、酶活性仍然存在差异,表明根、叶分解残余物仍可对生态系统养分循环相关过程产生不同影响。与根分解残余物比,叶分解残余物微生物受C源限制性大,其微生物对获取C的投入增多,F/B更低；但叶分解残余物微生物受pH胁迫小。氮磷添加对分解残余物的微生物群落结构无显著影响,但抑制了分解残余物AP的活性,提高了βG/NAG和βG/AP,表明外源养分输入对根叶分解残余物仍有激发效应。且氮磷添加对叶分解残余物βG/NAG的提升幅度更大,表明亚热带地区氮磷沉降可加剧杉木林叶分解残余物中微生物的C限制,这可能不利于分解后期杉木叶残余物养分的归还,延长叶分解残余物在生态系统中的存留时间。