KLF4、LDH联合P53预测DLBCL标准治疗反应性价值及意义

秦福丽 郭志强 李小雨

弥漫性大B 细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）占成人非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，呈弥漫侵袭性生长［1］。CHOP（硫酸长春新碱+环磷酰胺+盐酸表柔比星+地塞米松）或R-miniCHOP（减低剂量的CHOP）联合CD20 单克隆抗体利妥昔单抗是治疗DLBCL 标准方案，但部分患者仍出现复发或预后不良，呈现出不同的治疗反应性［2］。锌指样转录因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是含锌指结构的转录因子家族一员，在肾透明细胞癌中表达降低，且低表达KLF4 与大肠癌患者更差预后有关，但与DLBCL 治疗反应性关系尚未阐明［3-4］。乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）分布于机体肾脏、骨骼等多种组织和器官，在DLBCL 患者中水平升高，但是否可影响患者治疗反应性仍有待探讨［5］。P53 是一种抑癌基因，通过细胞凋亡、DNA 修复、诱导细胞周期阻滞及调控多种信号转导抑制肿瘤的发生发展，但在DLBCL 领域尚存在争议，在DLBCL 治疗反应性中扮演何种角色尚不明确［6］。基于此本研究探讨KLF4、LDH、P53 与DLBCL 标准治疗反应性关系及联合预测价值，报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选取2017年1月至2020年3月本院收治的62例DLBCL 患者，根据治疗反应性分为缓解组（n=42）、非缓解组（n=20）。纳入标准：①符合DLBCL诊断标准［7］；②无化疗禁忌症；③首次确诊与治疗；④免疫组化检查CD20 阳性。排除标准：①心肝肾功能严重不全者；②活性性出血者；③其他系统原发性恶性肿瘤者；④伴有急性感染类疾病者；⑤妊娠期、哺乳期者。本研究获医院伦理委员会审核通过，患者及家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 资料收集

收集患者年龄、性别、体质量指数、饮酒史、吸烟史、Ann Arbor 分期、受累部位、细胞起源亚型、合并疾病、国际预后指数（International Prognostic Index，IPI）评分［8］，其中IPI 评分于治疗前评估，0～5分，分值越高，预后危险度越高。

1.2.2 检测方法

治疗前通过活检获取DLBCL 标本，采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测KLF4mRNA，KLF4mRNA 的上游引物5′-GGCTGATGGGCAA GTTTGTG-3′，下游引物5′-CAAGTGTGGGTGGCTGTTCT-3′，以β-actin作为内参，内参β-actin的上游引物序列：5′-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游引物序列：5′-CGATGCCGTGCTC GATGGGG-3′，Ct（Cycle threshold）值是每个反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，收集Ct 值后应用ΔΔCt 法检测基因的相对表达量，试剂盒购于宝生物（大连）有限公司，严格按照试剂盒说明书操作；采用间期荧光原位杂交检测P53 基因缺失率，试剂盒购于上海岚派生物有限公司，P53 基因的5，和3，探针均为绿色荧光标记，基因丢失时仅显示1 个和0 个绿色信号；并于治疗前采集外周血5 mL，采用比色法检测血清LDH，试剂盒购于上海沪峥生物科技有限公司。

1.2.3 治疗方法及治疗反应性评估［7］

＜80 岁患者，采用CHOP 联合利妥昔单抗注射液，≥80 岁者采用R-miniCHOP 联合利妥昔单抗注射液，21 周为1 个治疗周期，共治疗6 个周期；治疗后疗效分为完全缓解、部分缓解、病情稳定、疾病进展，其中完全缓解、部分缓解纳入缓解组。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 处理数据，计量资料符合正态分布时以（）表示，行t检验，计数资料用n（%）表示，行χ2检验，采用Pearson 分析KLF4mRNA、LDH与IPI 评分关系，采用多因素Logistic 回归方程分析治疗反应性的相关影响因素，采用受试者工作特征曲线（ROC）及ROC 下面积（AUC）分析各指标预测治疗反应性的价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较

两组年龄、性别、体质量指数、饮酒史、吸烟史、受累部位、细胞起源亚型、合并疾病比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；缓解组Ann Arbor 分期、IPI 评分与非缓解组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组基线资料对比［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups［（±s），n（%）］

表1 两组基线资料对比［（±s），n（%）］Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups［（±s），n（%）］

资料年龄（岁）性别（男/女）体质量指数（kg/m2）饮酒史吸烟史Ann Arbor 分期缓解组（n=42）61.15±11.24 24/18 24.25±1.57 35（83.33）20（47.62）非缓解组（n=20）63.58±10.29 9/11 23.99±1.66 13（65.00）6（30.00）t/χ2值0.817 0.802 0.599 1.662 1.727 P 值0.417 0.370 0.552 0.197 0.189ⅠⅡⅢⅣ9（21.43）19（45.24）11（26.19）3（7.14）1（5.00）2（10.00）8（40.00）9（45.00）3.856＜0.001受累部位淋巴结内淋巴结外细胞起源亚型生发中心B 细胞样非生发中心B 细胞样合并疾病高脂血症糖尿病心脏病高血压IPI 评分（分）26（61.90）16（38.10）15（75.00）5（25.00）1.037 0.309 9（21.43）33（78.57）9（45.00）11（55.00）3.654 0.056 8（19.05）10（23.81）1（2.38）6（14.29）1.40±0.42 3（15.00）3（15.00）2（10.00）1（5.00）2.61±0.59 0.001 0.214 0.454 0.424 9.271 0.973 0.644 0.500 0.515＜0.001

2.2 两组各指标比较

缓解组KLF4mRNA 高于非缓解组，LDH、P53基因缺失率低于非缓解组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组各指标比较［（±s），n（%）］Table 2 Comparison of indicators between 2 groups［（±s），n（%）］

表2 两组各指标比较［（±s），n（%）］Table 2 Comparison of indicators between 2 groups［（±s），n（%）］

指标KLF4 mRNA LDH（U/L）P53 基因缺失率缓解组（n=42）0.97±0.30 267.52±85.63 18（42.86）非缓解组（n=20）0.56±0.14 368.49±90.82 16（80.00）t/χ2值5.800 4.257 7.547 P 值＜0.001＜0.001 0.006

2.3 KLF4 mRNA、LDH 与IPI 评分关系

采用Pearson 进行相关性分析，结果显示，KLF4mRNA 与IPI 评分呈负相关（r=-0.646，P＜0.001），LDH 与IPI 评分呈正相关（r=0.623，P＜0.001）。

2.4 治疗反应性的多因素Logistic 回归方程分析

Logistic 回归方程分析显示，将Ann Arbor 分期、IPI 评分控制后，KLF4mRNA、LDH、P53 基因缺失仍与治疗反应性相关（P＜0.05）。见表3。

表3 治疗反应性的多因素Logistic 回归方程分析Table 3 Multivariate Logistic regression equation analysis of treatment response

2.5 各指标预测治疗反应性的ROC

以缓解组为阳性样本，以非缓解组为阴性样本，绘制各指标预测治疗反应性的ROC，结果显示，KLF4mRNA+LDH+P53 基因预测缓解的AUC为0.962，大于各单一指标。见表4、图1。

表4 ROC 分析结果Table 4 ROC curve results

图3 各指标预测治疗反应性的ROCFigure 3 ROC of each index predicting treatment response

3 讨论

KLF4基因定位于9q31，在巨噬细胞、血管内皮等机体多种组织和细胞中均有表达，参与细胞生长、增殖、凋亡等多个生命活动的调控［9-10］。本研究结果显示，与缓解患者相比，非缓解患者KLF4mRNA 较低，与IPI 评分呈负相关，是治疗反应性的相关影响因素。林志美等［11］报道，KLF4mRNA 在DLBCL 患者中水平降低，增加KLF4mRNA 表达可抑制DLBCL 细胞增殖和侵袭迁移，证实KLF4mRNA 具有抑癌作用。高表达的KLF4mRNA 能破坏新生血管形成，阻断肿瘤细胞血供，诱导肿瘤细胞凋亡，KLF4 mRNA高表达时，还能抑制磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B 通路的异常激活，从而对DLBCL 发挥抑制作用［12］。后续的ROC 分析显示，当KLF4 mRNA＞0.85 时，预测缓解的AUC为0.829，能为临床提供量化的数据参考。

LDH 系糖酵解酶，分布于机体所有组织细胞的胞质内，被认为是DLBCL 患者预后的相关影响因素，但对DLBCL 标准治疗方案治疗反应性影响的报道较少［13］。本研究结果表明LDH 具有作为治疗反应性预测标志物的潜质。LDH 与肿瘤微环境、线粒体呼吸抑制等有关，当发生肿瘤时，即使在供氧充足调节下，肿瘤细胞糖酵解作用亦加强，以满足恶性增殖的需求，故伴有LDH 升高，因此LDH 常被用于肿瘤的诊断、疗效及预后的判断。本研究发现，LDH 水平越高，治疗反应性越差，这可能是LDH 较高患者，肿瘤糖酵解作用较强，肿瘤细胞恶性增殖较明显造成的，可见临床上对LDH 水平较高患者宜进行全面的评估，必要时联合其他方案或更换二线方案，以增加患者受益，促进病情转归。

P53基因定位于17p13.1，具有抑制肿瘤发生和进展的作用［14］。研究［15］发现，P53基因突变与DLBCL 发病密切相关。目前关于P53基因在恶性肿瘤领域表达情况存在较大争议，如丁欣等［16］报道，P53 阳性患者总生存和无进展生存期缩短，呈现出更差的预后。造成这种差异的原因是P53 阳性定义方法不同造成的，丁欣等将P53基因发生了突变定义为P53 阳性，柴成国等将P53基因缺失定义为阳性，在此前提限定下，P53 基因突变与P53基因缺失从本质上讲，意义是相同的，因此认为研究结果是一致的。P53基因能通过编码细胞周期调控蛋白，控制细胞分裂周期的启动，并能介导与启动损伤细胞的凋亡活动，起到减缓和监视细胞分裂作用，当P53基因突变或缺失时，对细胞周期控制功能和细胞凋亡活动的管理能力减弱或消失，故呈现出促癌作用。

综上，KLF4mRNA、LDH、P53 基因缺失与DLBCL 标准治疗反应性及预后有关，在缺乏有效手段时，可作为预测缓解的标志物为临床提供重要参考信息。