近红外自体荧光成像对术中甲状旁腺实时识别的初步研究

张颖超 陈承坤 伍波 于凡 邓先兆 郭伯敏 康杰 樊友本

在过去的30年里，全世界甲状腺癌(thyroid cancer,TC)的发病率显著增长[1]。据2018年全球癌症统计，甲状腺癌新发病例56.7万，占女性肿瘤负荷的5.1%[2]。在甲状腺手术量激增的同时，术中甲状旁腺(parathyroid gland,PG)误切或血运损伤这一最常见且较严重的手术并发症难题亟待解决。它导致了甲状旁腺功能减退(hypoparathyroidism,HypoPT)，主要特征是低钙血症，其中暂时性HypoPT的发生率为6.9%～49%，永久性为0.4%～33%[3]，需长期口服钙剂或活性维生素D，剂量控制不佳则造成高钙或低钙血症，远期则可能出现异位钙化或肾结石等[4]。在甲状腺全切术中，保留所有的PGs是一个非常重要的手术目标，但由于甲状腺疾病的程度、PG的数目特别是解剖位置和血供的差异，很难全部发现和完整保留。尽管手术技巧、纳米炭负显影、亚甲蓝染色、快速冰冻病理、自体移植等各个方面均已有相当广泛的的研究，但最佳的PG保护方法仍没有定论，现阶段主要依靠手术医生的肉眼辨识，要求医师有相当丰富的专业知识和经验累积。近期研究发现，PG组织暴露于近红外光下表现出增强的自体荧光(autofluorescence,AF)，文献报道识别率可达到90%以上[5-6]，无需注射造影剂，客观且直观，检测到的腺体数量增加到3.5枚(肉眼识别2.6枚)[7]。本研究拟初步探索近红外自体荧光(near-infrared autofluorescence imaging,NIRAF)成像对术中PG实时识别的临床效果。

对象与方法

一、对象

2020年6～8月在我院甲状腺外科行甲状腺手术的病人59例，其中男性21例，女性38例。年龄22～80岁，平均年龄(53.1±13.6)岁。双侧甲状腺手术20例，单侧39例。病理诊断为甲状腺乳头状癌46例，嗜酸细胞癌2例，结节性甲状腺肿8例，甲状腺腺瘤2例，滤泡性肿瘤1例。病人既往均无颈部外伤及放疗病史。手术由同一治疗组医师完成，手术医师均具有10年以上甲状腺专科手术经历。根据术前专家超声/穿刺及术中冰冻切片，对恶性肿瘤病人行中央区清扫，部分病人附加侧区清扫。

二、方法

1.甲状腺手术：均采用开放术式，取颈部正中切口，切开皮肤后，常规游离皮瓣，切开颈白线直达甲状腺固有被膜，上下钝性分离，暴露甲状腺。超声刀离断甲状腺峡部，“脱帽法”处理甲状腺上极。牵引甲状腺，暴露甲状腺背侧。然后紧贴甲状腺固有被膜精细化解剖PG并保留其血供。甲状腺及气管旁淋巴结清扫后，观察甲状腺床。手术标本送检前再次检查是否有PG误切。

2.PG辨识阳性判断标准：默认PG分别位于甲状腺背侧的左上、左下、右上、右下，且各有一个，即理论上双侧甲状腺手术应找到4个PG，单侧者则应为2个。故本研究将检出PG总数158枚。先进行PG肉眼辨识，由两名高年资手术医师同时确认方为阳性；再进行NIRAF辨识，除检测到AF外，还需符合PG常见大小、形态等相关特点才可判断为阳性。当肉眼和NIRAF判别情况不一致时，对可疑组织再采用免疫胶体金(佰奥达PTH免疫检测仪及检测试剂)验证是否PG。

3.NIRAF成像方式与探测时机：(1)NIRAF成像设备：设备整体观见图1。打开设备开关，进入控制界面，探头与设备主体进行无线或有线连接。关闭无影灯(仅亮手术室环境灯)，长按调节按钮，打开激发光，探测端垂直于手术区，距离10～15 cm左右，在显示器上进行动态显像。术野呈灰色，PG自发荧光呈现亮色或白色。(2)PG寻找及识别时间节点：分别在甲状腺被膜解剖前及标本切除后进行两次识别，必要时据手术医师的需求可增加成像次数。若离体标本检出PG，经免疫胶体金确认后则行同侧胸锁乳突肌自体移植。

A:整体观;B:激光探头(自上而下依次为探测端、激发光调节按钮、握持端)

4.免疫胶体金快速检测PTH流程:用含有0.1 ml生理盐水的1ml注射器穿刺可疑PG组织3～5次，1ml生理盐水洗涤注射器及针头3～5次，加入试剂进样孔，10 min后将试剂条插入机器检测孔，读取结果。PTH >63.99 pg/ml，即判定为PG组织。

三、统计学处理

结果

1.PG总体识别结果见图2。59例病人，共计切除79叶甲状腺，将检出上位、下位、总PG分别为79、79、158枚，实际分别检出74、70、144枚，PG检出率分别为93.6%、88.6%、91.1%。两种方法均未辨识到的PG有14枚。

图2 PG组织辨识流程

2.两种方法检出率的比较见表1。NIRAF成像与肉眼对于上位PG的检出率分别为93.7%(74/79)、88.6%(70/79)，下位PG分别为87.3%(69/79)、84.8%(67/79)，总体的PG检出率分别为90.5%(143/158)、86.7%(137/158)，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 59例病人的PG检出情况及两种方法检出率比较

3.两种方法准确率的比较见表2。NIRAF成像与肉眼对于PG识别准确率分别为98.6%(143/145)、100%(137/137)，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 两种方法准确率比较(Fisher确切概率法)

4.PG误切与自体移植的情况：本研究中6例病人进行了PG的同侧胸锁乳突肌自体移植，同时进行右侧上位及下位PG移植1例，进行右侧下位PG移植3例，右侧上位、左侧下位PG移植各1例。PG总体移植率4.4%(7/158)。移植的原因：1枚PG术中全程未检出，导致误切，离体组织中仅由NIRAF辨识到。6枚PG术中找到，其中4枚因操作或肿瘤/PG位置特殊导致PG血供离断，主动自体移植；2枚则因术中解剖变化，PG保护不佳致手术误切，后移植。

5.NIRAF成像与肉眼PG识别差异性与一致性比较见表3。就甲状腺被膜解剖前这一重要阶段而言，配对χ2检验，NIRAF的检出率为55.7%(88/158)，肉眼为31.6%(50/158)，NIRAF检出率显著高于肉眼(P<0.05)；Kappa=0.514，P<0.05，Kappa在0.41～0.6之间，一致性中等。最终识别结果，配对χ2检验提示两种方法的识别结果差异无统计学意义(P>0.05)；Kappa=0.750，P<0.05，Kappa在0.61～0.8之间，有较高度的一致性。

表3 两种方法识别差异性与一致性比较(枚)

6.NIRAF成像的PG位置预见性及优越性见表3。甲状腺被膜解剖前，NIRAF检出率为55.7%(88/158)，肉眼为31.6%(50/158)，有38枚(24.1%，38/158)PG为NIRAF先于肉眼提前发现，且差异有统计学意义(P<0.05)。NIRAF成像可在术中进行PG的实时识别(图3)，而不受解剖阶段的限制。同时，对于与胸腺组织、脂肪组织混杂或难以区分的PG，或组织破碎、解剖辨识困难的离体组织，NIRAF成像更为直观且客观(图3G～J)。

讨论

研究发现，PG与背景组织平均荧光强度的比率为4.78，且在所有情况下均大于1[6]，故PG在近红外光下表现为低荧光背景上的高荧光点。NIRAF成像的实际益处，需要回答两个问题：术中是否通过荧光对比提高了外科医生识别PG的能力，降低误切和自体移植率；是否保护了PG功能，降低甲状腺全切术后低钙血症的发生率。

A：甲状腺被膜解剖前-室灯下术野；B：甲状腺被膜解剖前-NIRAF成像；C：甲状腺被膜解剖后-室灯下术野；D：甲状腺被膜解剖后-NIRAF成像；E：甲状腺床-室灯下术野；F：甲状腺床-NIRAF成像；G：离体标本-室灯下术野；H：离体标本-NIRAF成像；I：胸甲韧带旁腺室灯下术野；J：胸甲韧带旁腺NIRAF成像

一组前瞻性研究报道，173例甲状腺术中发现98.6%(496/503)的PG存在AF，137例甲状旁腺术中发现AF的比例为96.4%(451/468)。550例标本经病理验证，NIRAF预测PG的敏感度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为98.5%、97.2%、95.1%和99.1%，总体准确性为97.6%(537/550)[5]。其他多中心研究也发现NIRAF检测PG中AF的总体灵敏度为98%(584/594)[8]。其准确性甚至可达到100%[6]。259张疑似PG组织的NIRAF图像均经肉眼检查证实[9]。本研究中，NIRAF成像的PG检出率为90.5%，准确率为98.6%，NIRAF与肉眼识别结果的一致性较高。这可能是由于本研究严格规定以PG大小、形状、常见位置特点为前提判断AF(+)，减少了假阳性率，然而很可能降低了检出率；肉眼识别PG的准确性达到了100%，一方面得益于三级医院甲状腺中心手术医师的技能与经验丰富，另一方面是我们规定了两名高年资手术医师同时确认PG才判定阳性的前提。但值得肯定的是NIRAF辨识PG的良好可行性，不逊于甚至优于肉眼识别的能力，可达到甲状腺专科优秀手术医生肉眼识别的水平，且它的应用将外科医师术中识别PG的信心从4.1分提高到4.4分(0～5分)[10]。故预计将对经验相对不足的专科甚至非专科医师产生更好的辅助效果，提高辨识率，缩短学习曲线，实现更好的PG原位保留。

据报道，32%(162/503)的PG在外科医生被膜解剖前，仅被NIRAF识别，而未被肉眼识别[5]。甲旁亢术中20%(12/59)的病人使用术中NIRAF成像帮助识别了肉眼未检出的PG[10]。总体而言，手术全过程中77%(245/320)的PG可在肉眼识别之前先由NIRAF发现[9]。由于AF通过上覆组织的穿透性只有几毫米，在甲状腺被膜解剖前可能无法检测到来自所有PG的AF信号，但随着解剖的深入，暴露愈加充分，这些PG随后被检测到。本组病例在外科医生被膜解剖前，通过AF可以识别55.7%(88/158)的PG，最终识别率达90.5%(143/158)。当被脂肪和结缔组织覆盖时，可能影响干扰肉眼识别，采用荧光辅助早期识别，目的是尽早判别PG大致方位以便于寻找保护其潜在的血供，尽可能避免无意识的PG损伤或血流离断，防患于未然，故提前预判PG位置可能比最终识别的PG数目更重要。

PG误切、血运损伤或自体移植可导致术后低钙血症[3，11]，甲状腺手术中发生PG误切的比例为5.2%～21.6%[12]，暂时性低钙血症的发生率为5%～35%，永久性低钙血症的发生率为0.5%～4.4%[13-14]。有前瞻性多中心RCT研究表明，241例甲状腺全切术中应用NIRAF，将术后暂时性低钙发生率从22%降到9%，而PG自体移植和误切率分别从13.3%降到3.3%和11.7%降到2.5%[15]。其他对照研究表明，NIRAF组PG误切、移植率和术后低钙血症发生率分别为1.1%，2.1%和5.3%，而肉眼识别组分别为7.2%，15%和20.9%[9]。在5%(7/137)的病人中，NIRAF在甲状腺手术标本中鉴别到被误切的PG，从而挽救性进行了PG自体移植[5]。本研究中PG总体移植率4.4%(7/158)，其中2例类似，为手术医师肉眼未察觉的误切；另有1枚PG术中全程肉眼和荧光均未检出，在手术标本中由NIRAF意外发现。故对于缺乏解剖标志参考、组织成分混杂的离体组织，NIRAF可以清晰客观地展示是否存在AF，对误切或甲状腺床未找到的PG进行“捡漏”，指导自体移植，作为PG功能保护的“最后一道防线”。总之，应用NIRAF识别PG，提高了识别率及原位保留率，并降低自体移植率及术后低钙血症发生率。

A：离体标本-离体组织正面，NIRAF见自体荧光(蓝色箭头均指示甲状旁腺)；B：离体标本-离体组织反面，NIRAF荧光不明显；C：甲状腺床-室灯下术野；D：甲状腺床-NIRAF成像(绿色箭头均指示线结)； E：甲状腺床-室灯下术野；F：甲状腺床-NIRAF成像(黄色箭头均指示线结)

有研究发现，年龄、性别、BMI、PG大小和PG位置(上/下)与AF表现无相关性，甚至越小的PG越易被肉眼忽略，而被NIRAF捕捉到[8]。本研究也发现，NIRAF成像对于上位、下位PG的检出无明显差异。此外，探测到了手术区域的非特异性荧光显影：在离体组织标本中发现，同一标本正反两面成像效果不同(图4A、B)，术中多次发现线结有明显的荧光成像(图4C、D)；甲状旁腺区域呈现片状荧光显影，组织指向性不强(图4E、F)；皮肤毛孔、手术器械存在反光现象。这可能与介质反光、PG包膜不完整有关，造成假阳性。被覆组织的厚度也影响了NIRAF成像效果：部分病例甲状腺腺体本身或肿瘤较大，离断上极后，甲状腺背侧无法完全暴露，可能影响AF的充分探测，造成假阴性。可以借助拉钩向对侧拉开腺体，侧向探测，旋转手术床以升高便于探测甲状腺床。故NIRAF(+)的定义应该为“AF信号比周围组织亮，并且符合PG的典型大小和形状标准”。因此，虽然在甲状腺和其他颈部组织中可检测到AF，但由于信号的亮度、形状和大小的不匹配，很少会与PG的AF混淆。对于大多数腺瘤而言，荧光也是均匀的，少数情况出现不均匀的斑片状，可能与病理表现的PG组织硬化或部分退化有关[16]。

每次NIRAF的探测过程一般需耗时2～3分钟，术中需进行2～4次探查，且需关闭手术室灯光，理论上造成手术暂时中断及手术时间轻微延长，但既往报道表明，应用NIRAF与常规手术的平均手术时间基本一致[9]，甚至可以节省手术时间。在传统的甲状腺手术中,外科医生必须持续集中精力以避免损伤这些微小、难以区分的PG腺体,往往无意切除和自体移植反而会延长手术时间。因此，NIRAF在提高外科医生寻找辨认PG信心、改善预后的同时，并不明显造成手术时间延长。

Paras等[17]首次报道了PG在近红外光下的自荧光特性，国外研究多集中于临床应用及效果评估。基于组织含量的差异，猜测可能与钙敏感受体或者维生素D受体有关。

国内对于NIRAF的研究刚刚起步[18-20]。本研究病例数也相对偏少，未进行双侧甲状腺术后低钙血症的详细分析。初步结果表明，NIRAF与肉眼识别有较好的一致性，肯定了其高灵敏度、无需造影剂、实时、客观、直观等优越性，也在具体操作过程中对于拍摄角度、距离、阳性确认方式等细节把握更加精准，简化了操作流程，在此基础上将进行更为高质量的RCT研究，充分发挥NIRAF对于PG的预判优势及进行离体PG的挽救性移植，更好地辅助佐证肉眼定位PG腺体，明显减少术后HypoPT。