蟛蜞菊内酯通过抑制JAK2/STAT3信号通路诱导人肺腺癌A549细胞凋亡*

姜 姗， 刘 淼， 张 黎， 干银弟

湖北省第三人民医院病理科，武汉 430033

蟛蜞菊内酯(Wedelolactone)是一种重要的小分子活性化合物，属呋喃香豆素类，主要来源于旱莲草。已有研究证实，蟛蜞菊内酯具有保肝[1]、抗免疫抑制[2]、抗炎症[3]、促骨分化[4]等药理作用。蟛蜞菊内酯抗肿瘤作用已逐渐被发现，且其无明显的毒副作用，但相关研究还较少。Nehybová等[5]研究发现蟛蜞菊内酯可以作为乳腺癌细胞中多种蛋白酶的抑制剂，抑制乳腺癌细胞肿瘤活性。Sarveswaran等[6]研究表明，蟛蜞菊内酯可以通过Caspase依赖凋亡途径诱导前列腺癌细胞发生凋亡。然而，有关蟛蜞菊内酯对肺癌细胞的作用研究还未见报道。Janus激酶2/信号转导与转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路是众多细胞因子信号转导的共同途径，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及炎症等过程[7]。研究表明[8-9]，在肺癌等多种肿瘤组织及肿瘤细胞中发现JAK2/STAT3信号通路的异常激活，并参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程。因此，本研究拟探讨蟛蜞菊内酯对肺腺癌细胞A549凋亡的影响，试图明确其凋亡机制是否与JAK2/STAT3信号通路相关，以期为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

人肺腺癌细胞A549购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；Ham’s F-12K培养液购自美国Invitrogen公司(货号：21127022)；蟛蜞菊内酯购自美国Sigma-Aldrich公司(货号：W4016，纯度≥98%)；噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司(货号：M2128，纯度≥98%)；甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(货号：M1664，纯度≥98%)；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(货号：C1063)购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人p-STAT3(Tyr705)单克隆抗体(货号：#9145)、兔抗人STAT3单克隆抗体(货号：#12640)、兔抗人p-JAK2(Tyr1007/1008)多克隆抗体(货号：#3771)、兔抗人JAK2单克隆抗体(货号：#3230)、小鼠抗人Bcl-2单克隆抗体(货号：#15071)、兔抗人Bax多克隆抗体(货号：#2772)、兔抗人Cleaved Caspase-3单克隆抗体(货号：#9664)均购自美国Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(货号：sc-293335)购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 细胞培养

A549细胞复苏后接种于Ham’s F-12K培养液中(含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)，于37℃、5% CO2的培养箱中培养，倒置显微镜下观察细胞生长状态，待细胞融合度达到70%～80%时进行传代。

1.3 MTT法检测细胞增殖情况

取对数生长期的A549细胞，0.25%胰酶消化后制备成细胞悬液，以1×103个/孔接种于96孔板中，置于CO2培养箱中贴壁培养24 h后，分别加入蟛蜞菊内酯浓度为0、5、10、20和40 μmol/L的溶液，分别培养12、24和48 h。培养结束后弃上清，每孔加入终浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μL，振荡后于37℃培养箱中培养4 h，弃上清每孔加入100 μL二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)，轻轻振荡10 min，待紫色甲瓒颗粒充分溶解后，置于酶标仪上测波长为570 nm处的A值，根据公式：抑制率=(1-实验组/对照组)×100%，计算细胞增殖抑制率。实验重复3次，取均值。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期的A549细胞，根据实验需要分为：对照组，加入等体积0.1%的DMSO；甲氨蝶呤组(MTX)，作为阳性对照组，加入2 μg/mL MTX；蟛蜞菊内酯组(WDL)为实验组，加入20 μmol/L蟛蜞菊内酯溶液。细胞分组处理后继续培养24 h，采用0.25%胰酶消化细胞并收集细胞，调整细胞密度为2×105个/mL，经离心、洗涤后，加5 μL Annexin Ⅴ-FITC混匀，再加5 μL碘化丙啶(Propidium iodide，PI)充分混匀，避光孵育15 min，上流式细胞仪进行检测，实验重复3次。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期

细胞分组处理后，收集细胞并调整密度为1×107个/mL，400×g离心5 min。700 μL无水乙醇于-20℃中固定24 h，700×g离心5 min，PBS洗涤2次。加入RNaseA溶液消化30 min，再加入400 μL PI溶液，避光孵育10 min，然后进行流式细胞仪检测，确定细胞在各细胞周期中所占比例，实验重复3次。

1.6 Western blot实验检测相关蛋白表达

收集细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上充分裂解30 min，4℃，12000×g离心20 min，收集上清，进行蛋白定量。取20 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温孵育1 h。分别加入p-STAT3(Tyr705)抗体(1∶1000)、STAT3抗体(1∶1000)、p-JAK2(Tyr1007/1008)(1∶500)、JAK2(1∶1000)、GAPHD抗体(1∶2000)、Bcl-2抗体(1∶1000)、Bax抗体(1∶1000)和Cleaved Caspase-3抗体(1∶1000)4℃孵育过夜，洗涤3次，加入二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG(1∶10000)，室温孵育30 min，洗涤3次，加入适量ECL超敏发光液，应用天能Tanon 3500全自动数码凝胶成像分析系统显影，实验重复3次。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 蟛蜞菊内酯抑制人肺腺癌A549细胞的增殖

如图1所示，不同浓度(0、5、10、20和40 μmol/L)蟛蜞菊内酯处理A549细胞12 h时，各浓度蟛蜞菊内酯对细胞增殖抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。24、48 h时，与5 μmol/L和10 μmol/L比较，20、40 μmol/L蟛蜞菊内酯处理可显著抑制A549细胞增殖(P<0.05或P<0.01)。蟛蜞菊内酯对A459细胞作用24 h和48 h的IC50值分别为21.12 μmol/L和16.24 μmol/L，选择20 μmol/L蟛蜞菊内酯处理24 h进行后续实验。

与同时间段5、10 μmol/L WDL组比较，*P<0.05 **P<0.01

2.2 蟛蜞菊内酯促进人肺腺癌A549细胞凋亡

如图2所示，与对照组比较，甲氨蝶呤组和蟛蜞菊内酯组细胞凋亡率显著升高，差异具有统计学意义(均P<0.01)。

与对照组比较，**P<0.01

2.3 蟛蜞菊内酯促进人肺腺癌A549细胞周期阻滞

如图3所示，与对照组比较，甲氨蝶呤组以及蟛蜞菊内酯组G2期细胞比例显著升高(均P<0.01)。

与对照组比较，**P<0.01

2.4 蟛蜞菊内酯对人肺腺癌A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

如图4所示，与对照组比较，甲氨蝶呤组以及蟛蜞菊内酯组抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下调(均P<0.01)，促凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达显著上调(均P<0.01)。

与对照组比较，**P<0.01

2.5 蟛蜞菊内酯抑制肺腺癌A549细胞中JAK2/STAT3信号通路的激活

如图5所示，与对照组比较，甲氨蝶呤组以及蟛蜞菊内酯组A549细胞中JAK2和STAT3的磷酸化水平显著降低(均P<0.01)。

与对照组比较，**P<0.01

3 讨论

蟛蜞菊内酯作为中药旱莲草的提取物，据《广西药植名录》记载，蟛蜞菊具有“破瘀，消肿。治跌打、腹痛、风湿”等功效；《福建中草药》记载，蟛蜞菊具有“清热解毒，治白喉、百日咳、肺痨发热咳嗽、痢疾、肝火旺盛、烦热不眠、咽喉肿痛、齿龈炎。”等功效。现代医学研究证实，蟛蜞菊内酯可以抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡，包括乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞等，其机制与抑制多种蛋白激酶、雄激素受体、DNA拓扑异构酶Ⅱα、5-脂氧合酶等活性或蛋白表达相关[5-6，10-11]。本研究MTT检测结果初步发现，不同浓度的蟛蜞菊内酯处理可以显著抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖。说明蟛蜞菊内酯对肺腺癌A549细胞具有一定的杀伤作用，同时也提示蟛蜞菊内酯对肺腺癌的发展可能有一定的抑制作用。

细胞凋亡是一种在病理或生理条件下，受内在遗传机制调控而自主有序的细胞死亡方式。细胞凋亡受抑制在肿瘤发生、发展和转归方面均有相当重要的作用。本研究结果显示蟛蜞菊内酯可显著诱导A549细胞凋亡，促进细胞发生G2期阻滞。细胞凋亡与Caspase级联反应的激活有关，Caspase-3是Caspase家族中直接参与细胞凋亡执行过程的核心激酶，Caspase-3切割激活后可导致细胞解体[12]。Bcl-2和Bax是Bcl-2蛋白家族中两个作用完全相反的成员，Bcl-2发挥抗凋亡的作用，而Bax发挥促凋亡的作用[13]。Bcl-2能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制细胞凋亡。而Bax可与Bcl-2形成异二聚体，抑制Bcl-2发挥作用，具有促凋亡作用。本实验结果显示，蟛蜞菊内酯处理可上调A549细胞Bax蛋白的表达，并增强Caspase-3的切割激活，抑制Bcl-2蛋白的表达。说明，蟛蜞菊内酯可诱导A549细胞凋亡。

有研究显示，蟛蜞菊内酯可抑制STAT信号通路的活化[10]。而JAK/STAT信号通路的激活是多种恶性肿瘤发生的关键因素。JAK/STAT信号通路的传递过程相对简单，主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶(JAK)和信号转导与转录激活因子(STAT)[14]。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2；STAT家族是JAKs家族下游的一类靶蛋白，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6。其中JAK2/STAT3信号通路是参与人体生理与病理反应的一条重要途径，与肺癌的发生和防治密切相关。本研究结果显示，蟛蜞菊内酯可显著降低肺腺癌A549细胞JAK2和STAT3的磷酸化水平。

综上所述，蟛蜞菊内酯可诱导肺腺癌A549细胞发生周期阻滞，促进凋亡，其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路激活有关。