基于网络药理学探讨预知子治疗肝癌的作用机制*

陈文成， 王 纯， 陈 涛， 胡 卫， 曾建红

三峡大学医学院，国家中医药管理局中药药理(肿瘤)科研三级实验室，宜昌 443002

在全球范围内，肝癌是最常见的致命恶性肿瘤之一，发展中国家发病率较高[1]，其中中国的病例数最多[2]。在原发性肝癌病例中，>90%是肝细胞癌，由于侵袭性和异质性高，传统治疗效果欠佳，预后极差[3]。早期诊断的肝细胞癌患者有机会接受切除手术、局部破坏性疗法或肝移植[4-5]，手术复发或晚期肝癌患者多采用化疗、放疗、靶向治疗等其他全身治疗方法[6]。中医具有独特的整体性和模式识别与治疗的特点，已成为肝癌防治工作的重要组成部分。研究表明中医药在减少肝癌复发转移、减轻放化疗的毒副反应、提高晚期肝癌患者的生活质量等方面发挥着非常重要的作用[7]。

预知子FructusAkebiae为木通科植物木通、三叶木通或白木通的干燥近成熟果实[8]，又名八月瓜、八月札等，在长江流域省份均有产，可食药两用，具有毒性小，来源广等优点。现代研究表明预知子具有抗菌、抗肿瘤、保护肝脏等作用，临床主要运用于治疗肝炎、抑郁、乳腺增生、胃溃疡、癌症等疾病[9]。通过检索中国知网近十年来与预知子的作用机制研究相关的文献资料，发现近年来涉及这方面的研究较少，但预知子在临床的应用却很广泛，迄今为止未报道相关严重毒性事件，新药开发有很大应用前景，尤其关于预知子抗肿瘤方面的研究前景较为广阔。大量临床研究表明预知子对肝癌细胞的恶性增殖有一定的抑制作用[10-13]。但其抑制肝癌细胞恶性增殖的具体机制尚无相关研究报道，该空缺在一定程度上阻碍了预知子在现代市场中的推广和应用。

网络药理学是以生物网络为基础，分析网络中药物、成分、靶点和疾病之间的关系和链接[14]。通过数据库检索、高通量组学数据分析和计算机模拟等手段，多层次网络构建及分析，深入探讨预知子治疗肝癌的潜在作用机制，为今后从微观角度阐释预知子治疗肝癌的作用机制提供了新的思路和途径，同时也为中药预知子的临床应用和相关药物开发起到积极的推动作用。

1 研究方法

1.1 药物有效成分及靶点的筛选

打开中药系统药理学数据库(TCMSP)官网界面[15]，在首页的“Herb name”栏下输入预知子进行检索，设定筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18两个指标，筛选出符合条件的预知子的有效活性成分；在“Related Targets”栏目下分别检索预知子有效活性成分相关的靶点蛋白；借助Perl语言和Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)，对靶点蛋白对应的人类基因名称进行标准化处理。

1.2 疾病相关靶点的筛选

分别以“liver cancer”、“hepatocarcinoma”为检索词在GeneCards及OMIM数据库中检索疾病相应靶点，合并去重后得到肝癌的相关靶点。

1.3 筛选共同靶点

利用在线韦恩图Venny 2.1取交集，获得预知子与肝癌的交集靶点。

1.4 构建可视化调控网络

使用Perl语言对数据进行属性标识，然后借助Cytoscape V3.7.2软件构建“药物-活性成分-疾病-靶点”的中药调控网络[16]；根据度值分析，得出作用靶点最多的有效活性成分。

1.5 蛋白互作网络(PPI)的构建及核心蛋白的筛选

将上述共同靶点上传至STRING V11.0数据库进行检索，构建PPI网络[17]。设置隐藏游离节点，下载PPI图形及相应的tsv文件；最后，使用R语言对tsv文件进行处理，筛选出PPI网络中的核心蛋白，设置P值最小的前30个结果以条形图的形式展示。

1.6 GO功能富集分析

借助R语言对得到的共同靶基因进行GO功能富集分析[18]。首先打开R软件，对相关安装包进行安装，利用Bioconductor平台的人类基因注释包(org.Hs.eg.db)运行对基因进行编码，再使用R语言的colorspace、stringi数据包及Bioconductor平台的DOSE、clusterProfiler、pathview数据包，对共同的关键靶基因进行GO功能富集分析(P<0.05，Q<0.05)，显示P值最小的前20个结果，并将结果以气泡图的形式输出。

1.7 KEGG通路富集分析

利用R语言对共同靶基因进行KEGG通路富集分析[19-20]。首先打开R软件，对相关安装包进行安装，利用Bioconductor平台的人类基因注释包(org.Hs.eg.db)运行对基因进行编码，再使用R语言的colorspace、stringi数据包及Bioconductor平台的DOSE、clusterProfiler、pathview数据包，对共同的关键靶基因进行KEGG通路富集分析(P<0.05，Q<0.05)，显示P值最小的前20个结果，并将结果以条形图的形式输出。

2 结果

2.1 预知子活性成分及作用靶点的筛选结果

通过运用TCMSP数据库对预知子进行检索，并以OB≥30%、DL≥0.18为限制条件进行筛选，共获得6个有效活性成分，见表1。然后使用Perl语言和Uniprot数据库，将两个数据库得到的检索结果进行合并去重处理，最后得到27个作用靶点。

2.2 肝癌相关作用靶点的检索结果

百度搜索并打开网页版GeneCards和OMIM数据库，以关键词为“liver cancer”“hepatocarcinoma”进行检索，合并两个数据库的结果合并去重后共获得16784个肝癌相关的靶基因。

2.3 药物-疾病共同靶点的筛选结果

利用Venny 2.1对药物作用靶点和疾病治疗靶点取交集，得到药物-疾病共同靶点27个。分别是CASP3、JUN、CHRM1、ADRA1B、CASP8、CASP9、PTGS2，CHRM2、SLC6A4、PTGS1、PGR、NCOA2、KCNH2、CHRM3、SCN5A、CHRM4、PRKCA、BCL2、BAX、ADRA1A、ADRB2、CHRNA2、OPRM1、GABRA1、PON1、MAP2、NR3C2。

2.4 调控网络的可视化

利用Perl语言对有效活性成分及共同靶点进行属性标识后，打开Cytoscape V3.7.2软件，将上一步得到的数据导入进来，构建出“药物-活性成分-疾病-靶点”的可视化调控网络图(图1)。结果表明，预知子中连接度为前4的潜在活性成分为β-谷甾醇、谷甾醇、甘油亚麻酸酯、2-油酸甘油单酯，根据度值分析，与β-谷甾醇和谷甾醇相关的作用靶点最多，可能对肝癌有治疗作用的可信度高。图中六边形代表预知子，菱形代表肝癌，三角形代表预知子的有效活性成分，椭圆形代表关键靶基因。

图1 “药物-成分-靶点-疾病”网络图

2.5 PPI网络的构建及核心蛋白的筛选

打开STRING V11.0数据库，将上述27个共同靶基因导入，此时要特别注意勾选物种项为Homo sapiens(表示人类)，通过数据库的信息得到蛋白质相互作用关系，构建PPI网络，见图2。网络图中共包含24个节点，49条边，平均节点度值为4.08；其中节点代表蛋白，每条边则代表各个蛋白之间的相互作用关系。将下载的tsv文件用R语言进行处理，共获得CASP3、JUN、CHRM1、ADRA1B、CASP8、CASP9、PTGS2、CHRM2、SLC6A4等9个核心蛋白，见图3。

图2 蛋白相互作用图

图3 蛋白互作网络图中的核心蛋白

2.6 GO功能富集分析

GO功能富集分析由生物过程(biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(molecular function)三部分内容组成。运行R语言对共同靶点进行GO功能富集分析，得到气泡图，见图4～6。图中纵坐标表示通路的名称，横坐标表示富集基因所占的比例，气泡的大小表示富集的数目，气泡的颜色代表P值，P值越小颜色越红，P值越大颜色越蓝。

图4 GO功能富集分析的生物学过程图

GO功能富集分析涉及生物学过程和功能集中在膜电位的调节、对有毒物质的反应、细胞对药物的反应、细胞对铵离子的反应、G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、乙酰胆碱受体信号通路等；涉及细胞组分表达过程主要与突触后膜、突触膜、膜筏、膜微区、膜区等有关；与分子功能相关的过程主要与通道活性、被动跨膜转运活性、神经递质受体活性、门控通道活性、泛素蛋白连接酶结合、离子通道活性、底物特异性通道活性等有关。

图5 GO功能富集分析的细胞组分图

2.7 KEGG通路富集分析

借助R语言，对共同靶基因进行KEGG通路分析，得到69条通路。设置展示P值最小的前20条通路的条形图(图7)。图中横坐标表示富集的数目，纵坐标代表P值，P值越小颜色越红，P值越大颜色越蓝。

图7 关键靶基因KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析结果涉及神经活性配体-受体相互作用、乙型肝炎、细胞凋亡、钙信号通路、P53信号通路、人免疫缺陷病毒1感染及一些癌症信号通路。

图6 GO功能富集分析的分子功能图

3 讨论

本研究结果显示，预知子干预肝癌具有多成分、多靶点的特点；且同一成分可作用于多个靶点，根据Cytoscape度值分析可知，活性成分度值最靠前的是β-谷甾醇和谷甾醇。研究显示，β-谷甾醇在肿瘤的预防与治疗中都能起到重要作用，β-谷甾醇能够抑制肿瘤细胞的增殖与发生[21]、抑制肿瘤细胞的分化与增生[22]、诱发肿瘤细胞的凋亡[23]。陈浩等[24]研究表明β-谷甾醇能使IL-2升高(P<0.01)与IL-10降低(P<0.01)，增加抗肿瘤细胞因子的分泌，减少免疫抑制因子的分泌，从而抑制肿瘤的发展。林明珠等[25]研究表明β-谷甾醇能促进IFN-γ的表达、抑制IL-6的表达。IL-6是肿瘤微环境中的主要细胞因子之一，高水平的IL-6通过调节凋亡、增殖、生存、血管生成、侵入性和转移以及代谢等与癌症相关的多种信号通路，促进肿瘤的发生。抑制IL-6的表达或阻断IL-6的信号传导可抑制肿瘤的发生和发展[26]。IFN-γ是参与抗肿瘤免疫的最主要的细胞因子。IFN-γ通过细胞抑制、促进凋亡和免疫诱导作用，干预转化细胞的识别和清除等过程来发挥良好的抗肿瘤作用[27]。董贺等[28]研究表明谷甾醇可通过诱导肿瘤细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。因此，笔者推测β-谷甾醇和谷甾醇可能在预知子治疗肝癌的药理机制中发挥着较为重要的作用。

本研究中发现预知子治疗肝癌的关键作用靶点包括CASP3、JUN、CHRM1、ADRA1B、CASP8、CASP9、PTGS2、CHRM2、SLC6A4等。JUN是肝细胞癌相关原生基因[29]。c-Jun作为一种细胞转录因子，能够促进细胞周期进展和细胞增殖，c-Jun也可通过结合肿瘤的启动子来调节影响肿瘤侵袭和转移的一些基因的表达[30]。Trierweiler等[31]研究发现在乙型肝炎病毒相关肿瘤发生过程中，c-Jun通过促进肝细胞增殖以及发育不良的进程从而发挥着重要作用。Caspases(CASPs)是一种半胱氨酸依赖的天冬氨酸特异性蛋白酶，CASPs是细胞凋亡的重要介质，负责凋亡的启动和执行。根据其促凋亡功能，CASPs可分为启动型CASPs和效应型CASPs[32]。本研究中发现的CASP8、CASP9属于启动型CASPs，它们传输凋亡信号；CASP3属于效应型CASPs，执行最终的细胞死亡过程。细胞凋亡受损是癌症的一种标志。本研究中获得的共同靶基因CASP3和CASP8、CASP9都是细胞凋亡反应的关键调节因子，在肿瘤发生过程中，CASP3、CASP8和CASP9发挥着重要作用[33]。CHRM为乙酰胆碱M受体(G蛋白偶联型受体)，有研究表明乙酰胆碱受体和配体在调节细胞增殖和癌症进展中起着关键作用。神经元和非神经元乙酰胆碱的产生导致神经分泌、旁分泌和自分泌，促进细胞增殖、凋亡、迁移和其他对癌细胞生存和扩散至关重要的特征[34]。Espaol等[35]研究发现：CHRM1和CHRM2参与血管生成，而CHRM1、CHRM2和CHRM3参与细胞增殖。在胰腺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌等癌症中，都被报道发现有CHRM的表达[36]。Liang等[37]研究发现在肝细胞癌中，检测到ADRA1B的表达降低。Chen等[38]研究显示抑制PTGS2可激活PINK1/PRKN介导的有丝分裂，从而加速细胞凋亡，抑制肝癌的生长。

凋亡可能导致体细胞突变，现在也被认为会导致一些人类疾病，包括神经退行性疾病和恶性肿瘤[32]。JNK通路在蛋白水平上调c-Jun的表达，增加被诱导的c-Jun磷酸化，通过c-Jun/Src/STAT3通路与细胞凋亡相关[39]。而我们通过富集分析也发现细胞凋亡是重要的信号通路。肝癌一般分为原发性肝癌和转移性肝癌。原发性肝癌中>90%是肝细胞癌[3]，而肝细胞癌的主要病因是乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染[40-41]。HBV的慢性感染通过多种分子机制进入肝细胞癌的相关途径，包括HBV DNA整合、细胞应激诱导、肝细胞癌通路转活[42]。而通过KEGG富集分析显示乙型肝炎也是富集比较多的信号通路。有研究表明，HIV感染增加了HBV或HCV相关肝细胞癌的风险[43]。也有研究指出HIV与HCV或HBV的结合会导致渐进性肝损伤和慢性肝炎，最终导致晚期肝病，如肝硬化和肝细胞癌。这些结果可能与肝实质细胞和非实质细胞之间的凋亡介导的串扰、肝脏中炎症细胞的积聚、微生物移位和免疫反应受损等有关[44]。这些研究结果也跟我们通过富集分析发现HIV1感染的相关信号通路相吻合。Kaufmann等[45]研究发现钙信号通路可能在肝细胞癌的血管侵袭中发挥着重要作用。Zhao等[46]指出通过NF-κB/p53凋亡信号通路可诱导人类肝癌细胞的生长抑制和凋亡。Wang等[47]研究指出神经活性配体-受体相互作用的路径，可能在心脏保护中起到关键作用。但是其在肝癌中的干预机制还未见相关文献报道，未来可作为一个方向进行深入研究。