母鼠不同孕期巨细胞病毒感染对仔鼠发育及行为的影响

伍少莹，李旭芳，施 全，刘 磊，蒋凤菊

(广州市妇女儿童医疗中心妇产科部，广东广州 510220)

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染可引起脑炎、肝炎等器官功能受损[1]。亦可通过宫内感染或母乳喂养引起母婴传播[2]，对胎儿、婴幼儿造成发育迟缓、智力障碍等危害[3]。目前，国内外研究极少关注HCMV感染对子代精神行为的影响。本研究拟通过建立小鼠动物模型，探讨母代不同孕期CMV感染对子代精神行为的影响，为疾病诊疗提供临床思路及实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

2017至2020年期间，选取北京维通利华纯种动物室出生28天的BALB/c雌鼠36只(体重：10～12g/只)，国家级屏蔽环境内12/12h昼夜循环条件下自由进食饲养。

1.1.2小鼠巨细胞病毒

小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)Smith毒株由华中科技大学附属同济医院病毒实验中心惠赠，在BALB/c雌鼠唾液腺组织中传毒增殖并滴定出半数组织感染量(TCID50)后用于实验。

1.1.3主要仪器

①旷场试验仪：广州飞康生物科技有限公司提供；黑色旷场箱尺寸：50cm×50cm×30cm。②Morris水迷宫试验仪：上海移动信息科技有限公司产品；黑色圆桶：直径150cm×高60cm。③悬尾试验仪：上海欣软信息科技有限公司产品；隔音避光箱尺寸：50cm×50cm×70cm。④蔗糖：太古糖业(中国)有限公司产品。

1.2方法

1.2.1 MCMV全身播散型感染模型的建立

小鼠腹腔内注射TCID50MCMV悬液(1.36×105PFU/mL)0.2mL，建立MCMV全身播散性感染模型。

1.2.2分组及干预方式

实验小鼠随机分为12组(A1，A2，A3，B1，B2，B3，C1，C2，C3，D1，D2，D3)，每组3只。

A为孕期再感染组，B为既往感染组，C为孕期原发感染组，D为正常对照组；1是孕早期(孕第5天)腹腔注射，2是孕中期(孕第10天)腹腔注射，3是孕晚期(孕第15天)腹腔注射。孕前，A、B组分别腹腔注射MCMV 0.2mL，C、D组分别腹腔注射0.9%无菌生理盐水(sterile normal saline，NaCl)0.2mL。孕期，A、C组分别腹腔注射MCMV 0.2mL，B、D组分别腹腔注射0.9%NaCl 0.2mL。

1.2.3实验过程

适应期后，雌鼠随机进入不同实验组，根据组别要求行第1次腹腔注射。1周后，小鼠按雌∶雄3∶1合笼24h，分笼后检查雌鼠阴栓情况。有阴栓者单独饲养并在不同孕期分别腹腔注射MCMV或0.9%NaCl 0.2mL，产仔后母、仔鼠同笼合养到产后21天。产后第22天，母、仔鼠分笼饲养，每组随机抽取6只仔鼠进入实验。仔鼠出生第1天(定为0周)，记录出生体重，并记录第3周(定为3周)及第6周(定为6周)的一般情况及行为学特征。第6周行为学试验结束后，每组随机处死仔鼠3只，测量脑脏器重量系数及唾液腺中MCMV表达水平。

1.2.4小鼠一般习性观察

观察并记录小鼠体重(称重3次后求均值作为当时体重)、毛发(稀疏、浓密)、食欲(每5天记录1次饲料及水量的减少量)、活动(减少、增多、攻击行为)、对刺激反应(迟钝、活跃)。

1.2.5小鼠行为学试验

①旷场试验(open field test，OFT)记录仔鼠放入旷场箱正中格后5min内行为变化，计算“水平运动总距离”和“直立运动次数”。仔鼠4只爪子进入1格记录为水平运动，双前爪腾空或攀附墙壁记录为直立运动。②Morris水迷宫试验(water maze test，WMT)第1～6天是空间学习记忆能力试验，每天4次，同一时间开始，分次将仔鼠面向池壁，随机从4个象限不同入水点放入水池，记录仔鼠从入水到找出水下隐蔽平台并站立其上所需时间，记录“逃避潜伏时间”；第7天移掉平台，做空间探索试验，记录60s内仔鼠“穿越原平台位置次数”。③悬尾试验(tail suspension test，TST)仔鼠头部离地40cm向下悬挂，远端尾部固定。试验6min，观察最后4min内仔鼠不动时间(指无晃动及挣扎的时间)，记录“悬尾不动时间”。④糖水偏好试验(sucrose preference test，SPT)训练仔鼠适应饮糖水后开始试验。禁食禁水24h后给等重的2瓶水(1瓶2%蔗糖水，1瓶纯净水)，8h交换1次瓶子位置，16h后取走2水瓶，计算“糖水偏好指数”[糖水偏好指数(%)=糖水摄入量(g)/[糖水消耗量(g)+纯水消耗量(g)]×100%]。

1.2.6组织学评价

无菌分离被处死仔鼠的脑组织，计算脑脏器重量系数[脏器重量系数(%)=脏器重量/体重×100]。脑组织常规石蜡包埋、切片、HE染色、光镜检查病理损害情况。

1.2.7 Real time PCR法检测MCMV定量

无菌分离被处死仔鼠的唾液腺，Real time PCR法测量组织中MCMV DNA定量。

1.3统计学方法

2结果

2.1各组仔鼠体重变化

每组6只。出生体重：A组、C组均低于D组(td值分别为2.42、3.34，P<0.05)。3周时体重：A3组、C1组、C2组、C3组均低于D组(td值分别为2.57、2.63、3.46、5.08，P<0.05)；C2组、C3组低于C1组(td值分别为2.98、3.05，P<0.05)。6周时体重：仅C3组低于D组(td=6.77，P<0.01)，提示C3组仔鼠发育持续滞后于正常组。实验中，C2、C3组表现出不同程度的皮毛稀松、食欲差、活动少、对刺激反应迟钝等。

2.2各组仔鼠唾液腺组织中MCMV定量

除D组外，其他组别唾液腺组织中均检测出MCMV。其中，A、C组高于B组(td值分别为2.75、2.94，P<0.05)。说明母鼠有MCMV接触史的仔鼠，都有MCMV感染情况，假如孕期有新接触感染，仔鼠的病毒量会更高。

2.3各组仔鼠脑组织病理情况

2.3.1各组仔鼠脑脏器重量系数情况

脑脏器重量A1、C1组均高于D1组(td值分别为2.88、4.17，P<0.05)，且C1组高于A1组(td=3.06，P<0.05)；提示母鼠孕早期MCMV暴露对仔鼠脑组织有影响，母鼠孕早期原发感染的仔鼠受害更严重。B组与D组差异无统计学意义(td=0.46，P>0.05)，提示母鼠既往MCMV暴露对仔鼠脑组织影响很少。

2.3.2各组仔鼠脑组织病理情况

每组3只。B、D组仔鼠脑组织病理未见明显异常。A1、C1组仔鼠脑组织病理见明显异常情况，C1组较A1组严重。C1组仔鼠脑组织镜下可见神经元细胞明显水肿，排列紊乱拥挤，部分细胞变性坏死，细胞核消失，细胞核和细胞质内可见嗜酸性包涵体，间质水肿并淋巴细胞、单核细胞浸润。(见图1、图2)

图1 C1组(MCMV感染)仔鼠脑组织病理表现Fig.1 The pathological features of brain tissue of offspring mice in C1 group (with MCMV infection)

图2 D1组(无MCMV感染)仔鼠脑组织病理表现Fig.2 The pathological features of brain tissue of offspring mice in D1 group (without MCMV infection)

2.4各组仔鼠的行为学试验情况

3周时，与D组相比，A3、C1、C2和C3组仔鼠的水平运动总距离缩短(F值分别为11.4、9.03、10.95、19.04，P<0.05)，直立次数减少(F值分别为6.28、5.87、7.72、11.57，P<0.05)，悬尾不动时间延长(F值分别为9.14、13.37、14.45、23.26，P<0.05)，糖水偏好指数降低(F值分别为5.10、6.73、7.73、9.04，P<0.05)；A1、C1、C2和C3组仔鼠的逃避潜伏期时间延长(F值分别为19.22、28.02、21.77、23.43，P<0.05)，穿越原平台位置次数减少(F值分别为22.10、26.87、20.56、27.32，P<0.05)。

6周时，与D组相比，C3组仔鼠的水平运动总距离缩短(F=23.44，P<0.05)，直立次数减少(F=16.25，P<0.05)，悬尾不动时间延长(F=14.03，P<0.05)，糖水偏好指数降低(F=9.98，P<0.05)，提示C3组仔鼠的快感缺失及退缩行为的提升由婴幼期持续至成年期；A1、C1组仔鼠的逃避潜伏期时间延长(F值分别为15.33、23.78，P<0.05)，穿越原平台位置次数减少(F值分别为14.12、22.21，P<0.05)，提示A1、C1组仔鼠的学习及记忆能力持续低于正常对照组。

表1 母鼠孕早期腹腔注射的各组仔鼠的情况Table 1 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the first

(续上表)

表2 母鼠孕中期腹腔注射的各组仔鼠的情况Table 2 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the second trimester

表3 母鼠孕晚期腹腔注射的各组仔鼠的情况Table 3 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the third

3讨论

3.1研究CMV感染者子代行为学表现有重要临床意义

HCMV属疱疹病毒β亚科，人群感染率高，我国孕妇HCMV抗体阳性率约95%[4]，儿童感染率为83.2%～87.3%[5]。由于HCMV有亲神经特性，人孕期感染可导致胎儿脑积水、小头畸形、婴幼儿神经功能受损等情况[6]；目前无明确有效的孕期防治方案，先天感染的新生儿疗效较差，婴幼儿神经系统损伤难以逆转。因此，本研究拟通过动物实验来侧面反映这类儿童在成长中可能存在的精神行为学变化特征及危害程度，为改进妇幼保健工作提供实验依据。

3.2母代孕期MCMV感染直接影响子代出生体重

仔鼠出生体重结果显示：A、C组均低于D组(P<0.05)，B组与D组差异无统计学意义(P>0.05)；提示母鼠单纯既往感染(B组)对仔鼠出生体重影响不大，而孕期MCMV暴露(A组、C组)可对仔鼠出生体重产生一定影响，无论其是否有既往感染史。其原因可能是母鼠孕期免疫力低下，MCMV损害母鼠脏器功能直接影响妊娠结局[7]。

3.3母代孕期MCMV感染可能影响子代成年期体重

A组仔鼠体重变化显示：A1、A2组3周时正常(P>0.05)；A3组3周时低于正常(P<0.05)，6周时正常(P>0.05)。提示孕早、中期MCMV再感染的母鼠体内可能存在一定的免疫功能，该功能削弱了MCMV对母鼠机体的损害，使A1、A2组母鼠身体有充裕的康复时间，产后可正常抚养仔鼠。而孕晚期MCMV再感染的A3组母鼠，可能产后身体未能立即康复，出现短期消极抚养行为，导致A3组仔鼠体重恢复慢于A1、A2组。预示不良抚养行为可能是影响子代体重增长的因素之一[8]。

C组仔鼠体重变化显示：C1、C2组3周时低于正常(P<0.05)，6周时正常(P>0.05)；C3组3周及6周时均低于正常(P<0.05)。提示母鼠孕晚期原发感染(C3组)的仔鼠体重增长持续滞后。原因可能是母鼠孕期免疫低下，MCMV原发感染严重损害母鼠心、肝、脑等器官功能[7]，孕晚期原发感染的母鼠，身体未能康复就要接受分娩劳累及产后激素水平急剧变化的影响，还要承担抚养后代重任，导致母鼠身心疲惫，出现持续不良情绪及消极抚养行为，致使C3组仔鼠体重持续滞后。而孕早、中期原发感染的母鼠(C1组、C2组)可能因为有更多的时间让身体康复，得以在后期抚养过程中为仔鼠提供良性抚养，该良性支持有可能是C1、C2组仔鼠成年期体重恢复正常的原因[8]。

3.4母代体内的MCMV可通过多种途径感染子代

仔鼠唾液腺组织MCMV检测结果显示：6周时，A、B、C组仔鼠均有MCMV感染。提示母鼠不同时期MCMV感染，都有可能通过宫内、分娩、母乳喂养或同伴生活等途径感染仔鼠[9]。A、C组仔鼠的MCMV定量均高于B组，提示母鼠孕期MCMV暴露比既往感染的危害更大。

3.5孕早期MCMV暴露可影响子代一生的认知学习能力

WMT评估仔鼠学习记忆能力的结果显示：3周时，A1、C1、C2、C3组仔鼠的能力均低于正常(P<0.05)；6周时，C2、C3组仔鼠的能力恢复正常(P>0.05)，而A1、C1组仔鼠的能力仍低于正常(P<0.05)。结合6周龄仔鼠脑组织病理情况：A1、C1组仔鼠脑组织明显异常，揭示母鼠孕早期MCMV暴露可影响仔鼠一生的学习记忆能力。原因可能是孕早期缺乏胎盘屏障，MCMV感染母鼠后，在胎儿新生神经元细胞内高度聚集，损害仔鼠的脑功能，该不良影响持续至其成年[10]。而孕中、晚期MCMV暴露的C2、C3组仔鼠，有胎盘屏障保护，其不良影响仅在短期内表现：3周龄时认知学习能力下降，可能是受母鼠抚养期不良行为影响而出现的暂时现象，成年群居生活可改善该不良影响。

3.6子代婴幼期的行为学特征受母代抚养行为影响

OFT、TST、SPT结果显示：3周时，A3、C1、C2、C3组仔鼠有明显退缩行为(P<0.05)。提示孕期有MCMV暴露的A、C组母鼠身体机能受MCMV损害，从而影响母鼠的抚养行为及质量，导致仔鼠婴幼期的行为出现异常。

3.7子代成年期的行为学特征可能仍受母代不良抚养行为影响

OFT、TST、SPT结果显示：6周时，仅C3组仔鼠有明显退缩行为(P<0.05)。原因可能是C3组母鼠孕期初次感染MCMV，缺乏既往感染带来的免疫保护(如A组或B组)，母鼠各器官功能受损更严重，加上孕晚期感染，身体尚未康复就要承受分娩劳累及产后激素变化的影响，使C3组母鼠身心疲惫，出现较长时间的不良情绪及消极抚养行为，甚至可能贯穿整个抚养期，对仔鼠精神及行为的影响更加深远。这一发现与Jensen等[8]的研究报告相似，婴幼儿期长期缺乏关爱与照顾，不仅会影响子代的身体健康状态，而且会导致其出现与母代类似的不良情绪及行为；若考虑同组群体效应，情况可能更为严重。

综上所述，CMV传染性强，感染后可对宿主多器官造成不良影响，母代孕期感染可直接/间接影响子代身心健康成长。因此，建议女性在计划怀孕前至少3个月内确认既往HCMV感染的康复情况，以保证身体可承受妊娠及产后抚养的相关重任。对于无既往感染史者，建议其在孕早期及孕晚期也进行HCMV的检测，防治孕期原发感染的危害，保障母婴身心健康。