探讨极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症新生儿的临床特征、基因变异及其基因型—表型的关系

高 静 刘晓景 陈永兴 杨海花 卫海燕

郑州大学附属儿童医院 河南省儿童医院 郑州儿童医院内分泌遗传代谢科，河南省郑州市 450007

VLCADD属于临床较为罕见的脂肪酸代谢障碍性疾病，主要患病群体为婴幼儿，属于常染色体隐性遗传，经流行性病学调查研究发现，该疾病发病率在欧美国家中占1/85 000。ACADVL基因(OMIM609575)是该疾病的主要编码基因，属于VLCAD家族，其参与脂肪酸B氧化的部位为线粒体上。疾病主要类型为迟发型、婴儿型以及新生儿早发型。其中由感染、运动、运动不耐受以及肌无力导致的横纹肌溶解为迟发型的主要表现；肌无力、肝大以及低酮性低血糖为婴儿型的主要表现；Reye综合征、脑病、心肌病为新生儿早发型的主要表现[1]。经国外临床研究发现，该疾病的临床特异性诊断指标为十四酰基肉碱(C14：1)增加，故对该疾病的主要诊断方式为应用串联质谱技术对血酰基肉碱谱检测，但国内对该项研究仍较少。故本研究特选取近六年在河南省儿童医院收治的7例该疾病患者的尿有机酸、血酰基肉碱谱、实验室检查以及临床特点进行分析，探究该疾病的基因型与表型的相关性、实验室检查特点以及临床表现。报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 7例患儿均来自7个不同家庭，年龄2d～14岁，男4例、女3例，父母均非近亲婚配。诊断主要依靠ACADVL基因突变分析、尿气相质谱有机酸分析(GC-MS)及血串联质谱分析(LC-MS/MS)综合分析。所有检测的知情同意书均已被患儿及其家属签署。

1.2 方法 (1)所有患儿接受气相色谱质谱、串联质谱和尿常规、血碳酸氢根/阴离子间隙、血乳酸、血氨、肌酸激酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、血糖等常规实验室检查。给予所有患儿进行饮食干预，饮食应为低脂高碳水化合物[2]。并接受避免空腹、左旋肉碱以及补充中链甘油三酯等治疗。对患儿的尿气相质谱、血串联质谱以及各项生化指标定期随访复查。(2)接受气相色谱法尿有机酸以及酰基肉碱的串联质谱检测。于专用滤纸中加入患儿刚入院时采取的全血，对滤纸纸片中酰基肉碱的水平应用串联质谱(ABSciex，API 4000)检测[3]。并应用日本岛津有限公司生产的QP2010气相色谱对患儿的尿液中的有机酸的水平进行监测。(3)基因突变分析：抽取患儿父母以及患儿的外周血白细胞，应用天根生物有限公司生产的TIANamp血液DNA提取试剂盒将其DNA进行提取。该疾病的基因中有22个外显子，通过Primer Premier 5.0软件对引物进行设计。于灭菌双蒸水中加入1.25U DreamTaqDNA聚合酶、5μl 10×DreamTaqDNA聚合酶缓冲液、1μl 10μmol/L的引物、10nmol/L的dNTPs 1μl以及200ng的基因组DNA至50μl进行扩增反应，且所有试剂的生产公司均为Fermentas公司[4]。PCR反应条件：先进行1min的95℃预变性，进行30s 95℃变性。再给予30s 54～68℃退火。在给予40s的72℃延伸，总循环为32次。再给予10min的72℃延伸。纯化后，应用上海华大基因公司生产的AB1377测序仪对患者的DNA进行测定，并对比GenBank人类ACADVL基因，通过DNA双向测序进行突变外显子片段的证实[5]。并应用直接测序法对新错义突变进行鉴定，并对比50例健康人，将基因多态性排除。

2 结果

2.1 血酰基肉碱谱结果分析 7例患儿均有血十四烯酰基肉碱(C14：1)明显升高,可伴有C10降低，C14、C14:2、C16等升高。见表1。

表1 血酰基肉碱谱结果分析(μmol/L)

2.2 基因型与表型的相关性、实验室检查特点以及临床表现分析 尿气相质谱有机酸分析可发现二羧酸尿。4例为心肌病型，2例为肝型，1例为肌病型。其中3例心肌病型早期死亡，目前存活的1例心肌病型患儿是通过新生儿疾病筛查得以早期诊断和治疗。7例患儿ACADVL基因突变分析示不同位点均可出现突变，以错义突变为主，ACADVL基因突变谱高度异质。见表2。

表2 基因型与表型的相关性、实验室检查特点以及临床表现分析

3 讨论

随着气相质谱以及串联质谱技术的发展，遗传代谢性疾病的诊断率得以提高。但VLCADD疾病的检出在我国报道仍较少，这与该疾病在亚洲地区患病率较低有关，但该疾病的死亡率极高，只有通过早期诊断并给予及时有效的治疗保障患儿的生命安全。现本研究特通过对该疾病患儿的治疗、诊断、临床表现以及基因特点进行分析，对患儿的疾病特点进行探究，以找出确诊疾病的有效途径。

本研究表明，7例患儿均有血十四烯酰基肉碱(C14：1)明显升高,可伴有C10降低，C14、C14:2、C16等升高。这与只有当游离肉碱与C14-C18酰基辅酶A相结合后，才可将C14-C18从线粒体内脱离，而该疾病患者的组织中游离肉碱含量减少有关。本研究通过尿气相质谱有机酸分析诊断出伴有二羧酸尿症，但如患儿伴有横纹肌溶解或症状较轻，则不伴有二羧酸尿症，故以C14：1明显升高可作为该疾病的特

异性诊断指标。但同时经多项检查发现，本研究中的7例患儿的实验室检查结果、临床表现以及发病年龄均不相同，故不能通过C14：1升高程度判断患病严重程度。

本研究表明，7例患儿中4例为心肌病型，2例为肝型，1例为肌病型。其中3例心肌病型早期死亡，目前存活的1例心肌病型患儿是通过新生儿疾病筛查得以早期诊断和治疗。7例患儿ACADVL基因突变分析示不同位点均可出现突变，以错义突变为主，ACADVL基因突变谱高度异质。在不同种属中，该疾病蛋白的氨基酸位点多为高度保守点，故当其发生突变后，致病率较高。且通过软件将此类突变与其对应的野生型氨基酸的电荷特性、疏水性、功能、大小进行模型构建发现，突变直接改变了蛋白的二级结构，进而导致VLCAD蛋白与其他分子间的作用以及氢键的形成受到影响，进而导致疾病发生[6]。

综上所述，需通过基因诊断、实验室检查以及临床症状等多项检查对ACADVL疾病进行诊断，以期通过早期诊断改善患儿预后。