线粒体融合蛋白2对内毒素致急性呼吸窘迫综合征肺纤维化的影响*

许美霞，周 贤，戴 仲，刘 涛，许 涛

(华中科技大学同济医学院附属普爱医院重症医学科，武汉 430034)

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)病死率与肺纤维化的程度密切相关，在ARDS的早期即有肺纤维化的发生，针对ARDS早期纤维增生的治疗是改善ARDS预后的重要措施[1-5]。在细胞外基质金属蛋白酶、抗蛋白酶和炎症介质相互作用下，肺成纤维细胞异常增生，导致胶原合成增加，是ARDS患者发生肺纤维化的重要机制[1-3]。本研究从ARDS肺纤维化的发病机制出发，研究细胞增殖抑制基因(HSG，又称线粒体融合蛋白2，Mfn2)是否可通过抑制成纤维细胞的增生成为防治ARDS肺纤维化的有效途径。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

人胚肺成纤维细胞(HELF)购自中国科学院细胞资源库。内毒素(LPS)购自美国Sigma公司(批号14391)；rMnf2多克隆抗体(来源于鸡)和抗鸡二抗购自GenWay Biotech Inc公司；考马斯亮蓝法蛋白试剂盒及Sircol胶原测定试剂盒购自英国Biocolor公司。

1.2 方法

1.2.1人胚肺成纤维细胞(HELF)的培养

将冻存的HELF活化后，用含10%胎牛血清及双抗的DMEM培养基进行培养，12 h后更换新培养基。待细胞生长贴壁率达80%以上后进行消化传代，在倒置显微镜下观察细胞形态，选取细胞状态良好的HELF进行实验。

1.2.2LPS诱导HELF产生胶原

HELF常规培养，取对数生长期的细胞，予以不同浓度LPS(0.5、1、5、10 μg/mL LPS)刺激HELF，在各个时间点Sircol胶原测定试剂盒检测细胞内胶原蛋白水平。

1.2.3实验分组

将HELF分为对照组，LPS组，LPS+Adv-vector组，LPS+Adv-Mfn2组。(1)对照组：完全培养基培养。(2)LPS组：给予5 μg/mL LPS+培养液培养24 h。(3)LPS+Adv-vector组：腺病毒载体Adv-vector及LPS、DMEM培养基培养。(4)LPS+Adv-Mfn2组：腺病毒载体Adv-Mfn2及LPS、DMEM培养基培养。

1.2.4检测细胞内总蛋白及胶原蛋白水平

HELF细胞经分组诱导处理后，用考马斯亮蓝法测定细胞内总蛋白、Sircol胶原测定试剂盒测定胶原蛋白水平。细胞内胶原蛋白水平(μg/mg Protein)=待测样本的胶原含量(μg/mL)÷待测样本的总蛋白水平(mg/mL)。

1.2.5Western blot检测Mnf2蛋白表达情况

收集待测组织样品，BCA试剂盒测定待测样品蛋白浓度。用5% BSA室温封闭1 h。其中一抗用5%BSA封闭液按1∶200稀释，4 ℃孵育过夜。二抗(辣根过氧化物酶标记的IgG)用5% BSA封闭液按1∶2 000稀释，室温孵育2 h 。用ECL显影。

1.2.6MTT法检测HELF增殖情况

HELF细胞经分组诱导处理后，弃去旧培养液，每孔加入20 μL MTT孵育4 h后去除培养基，加入DMSO 100 mL，溶解结晶体后，多功能酶标仪在波长570 nm处测量吸光度(A)值，A值的大小反映细胞的存活状况。细胞存活率%=(给药组A值-阴性对照组A值)/(阳性对照组A值-阴性对照组A值)×100%。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度、不同作用时间LPS对HELF细胞内胶原蛋白的影响

不同浓度的LPS处理HELF 24 h，用Sircol胶原测定试剂盒测定胶原蛋白水平，不同浓度的LPS组(0.5、1、5、10 μg/mL)胶原蛋白水平与对照组比较差异均有统计学意义(P值分别为0.028、0.011、0.000、0.000)，且胶原蛋白水平随LPS浓度的增加呈增高趋势，LPS以浓度依赖性诱导HELF产生胶原蛋白。组间比较，LPS组(5 μg/mL)与LPS组(1 μg/mL)比较差异有统计学意义(P=0.000)，而LPS组(10 μg/mL)与LPS组(5 μg/mL)比较差异无统计学意义(P=0.68)，见图1。

用终浓度为5 μg/mL的LPS刺激HELF，检测LPS处理后不同时间(0、6、12、24、48 h)细胞内胶原蛋白水平，不同时间的LPS组(6、12、24、48 h)胶原蛋白水平与对照组比较差异均有统计学意义(P值分别为0.031、0.000、0.000、0.000)，且胶原蛋白水平随LPS刺激时间的增加呈增高趋势，LPS以时间依赖性诱导HELF产生胶原蛋白。组间比较，LPS组(24 h)与LPS组(12 h)比较差异有统计学意义(P=0.000)，而LPS组(24 h)与LPS组(48 h)比较差异无统计学意义(P=0.054)，见图1。

a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组相比较。

2.2 各组细胞Mnf2蛋白表达的情况

用终浓度为5 μg/mL的LPS刺激HELF 24 h，Western blot检测Mnf2蛋白表达的情况，LPS组较对照组Kv1.5蛋白表达明显下调(P=0.000)；LPS+Adv-Mfn2组较LPS+Adv-vector组、LPS组Mnf2蛋白表达上调(P=0.000)，见图2。

1:对照组；B:LPS组；3:LPS+Adv-vector组；4:LPS+Adv-Mfn2组；a：P<0.01，与对照组相比。

2.3 上调Mnf2表达对HELF增殖率及细胞内胶原蛋白水平的影响

LPS组采用终浓度5 μg/mL的LPS刺激12、24、48 h后，HELF细胞增殖率分别为1.01±0.02、1.76±0.01、2.04±0.01，较对照组明显增加(P<0.05)，而过表达Mnf2后， LPS+Adv-Mfn2组细胞增殖率分别为0.93±0.06、1.48±0.03、1.76±0.01，较LPS组明显降低(P<0.05)，见图3。

LPS组(终浓度5 μg/mL，刺激时间12、24、48 h)细胞内胶原蛋白水平分别为73.39±0.30、76.01±0.22、76.90±0.30，较对照组显著增加(P<0.05)； LPS+Adv-Mfn2组胶原蛋白水平分别为72.12±0.30、73.21±0.26、73.46±0.25，较LPS组显著减少(P<0.05)，见图3。

图3 各组HELF细胞增殖情况及细胞内胶原蛋白水平变化

3 讨 论

肺成纤维细胞增生、胶原蛋白合成增加是ARDS肺纤维化的关键因素[2]。肺内胶原蛋白85%由肺成纤维细胞产生，胶原蛋白水平是肺纤维化程度的重要指标[6]。LPS是革兰阴性杆菌(G-)细胞壁的特征性成分，其可以促进多种固有细胞及炎性细胞分泌细胞因子。研究发现，通过LPS作用于体外培养的炎性细胞，将产生的细胞因子或活化的炎性细胞碎片与肺成纤维细胞共同培养，可诱导成纤维细胞产生胶原蛋白增加[7-8]。本研究以不同浓度及时间LPS作用于HELF，与对照组比较胶原蛋白水平明显增加，证实LPS以浓度及时间依赖性诱导HELF产生胶原蛋白，作为ARDS肺纤维化细胞模型，成功地诱导了肺成纤维细胞胶原蛋白产生的增加。

Mfn2是我国学者陈光慧利用差异显示技术发现的一个新基因。研究发现，Mfn2能够通过抑制Ras-Raf-ERK/MAPK信号通路的激活，增加细胞周期蛋白(CDK)抑制因子p21或p27的表达，降低视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的磷酸化，使低磷酸化、抑制增殖的Rb蓄积，从而阻止G1/S期转换，使细胞周期阻滞在G1/G0期，从而抑制细胞增殖[9-10]。在肿瘤和血管狭窄性疾病研究中，Mfn2在抑制肿瘤细胞和血管平滑肌细胞生长、诱导细胞凋亡发挥重要作用，阻止其异常增生，是近年来调控肿瘤生长转移和血管狭窄性病理生理过程的重要靶点[11-14]。除此之外，WANG等[15]发现在盆腔器官脱垂患者子宫骶韧带中提取的成纤维细胞中Mfn2表达水平升高，Mfn2可通过Ras-Raf-ERK信号通路抑制成纤维细胞的增殖和前胶原蛋白水平。ARDS肺纤维化涉及成纤维细胞异常增殖。因此，本研究推测Mfn2功能状态可能与ARDS肺纤维化密切相关。本研究发现Mnf2蛋白在人胚肺成纤维细胞中存在表达，且LPS刺激后Mnf2蛋白表达下调，肺成纤维细胞增生，胶原蛋白产生增加，提示Mnf2蛋白可能与LPS诱导的ARDS肺纤维化有关。

为进一步证实Mnf2蛋白与ARDS肺纤维化的关系，通过转染腺病毒Adv-Mfn2，过表达Mnf2蛋白，观察成纤维细胞增殖情况及胶原蛋白产生情况，发现予以过表达Mnf2蛋白后，成纤维细胞增殖明显减少，细胞内蛋白总量及胶原蛋白水平明显降低。因此可推断过表达Mnf2蛋白，可减轻成纤维细胞增生，减少胶原蛋白的产生。

综上所述，LPS作用于成纤维细胞后，Mnf2蛋白表达下调，胶原蛋白产生增加，而上调Mnf2蛋白表达可减轻LPS导致的成纤维细胞增生，减少胶原蛋白的产生。证实Mnf2蛋白可能在ARDS肺纤维化中发挥重要作用。