脓毒性心肌病患者血浆microRNA表达谱差异的初步研究

洪澄英， 陈怀生， 陈友莲， 刘晓君， 刘雪燕

（深圳市人民医院重症医学科，暨南大学附属第二临床医院，广东深圳518020）

脓毒症定义为由宿主对感染的反应失调引起的威胁生命的器官功能障碍［1］，严重威胁人类健康。研究显示，在脓毒症患者中，约60%可存在脓毒性心肌病［2］，其中约20%为重度心力衰竭，当左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）≤0.40 时，其病死率可达70%［3］。而早期识别脓毒性心肌病，尽早给予相应治疗，是降低脓毒症患者死亡率的关键之一。临床上心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）等生物标志物是检测早期心肌损伤的重要标志物［4］，但这些生物标志物可能在重症患者中显示出局限性，尤其是合并基础心脏病如冠心病的患者，其升高往往受多种因素影响，并不能作为脓毒性心肌病的早期诊断依据。血浆微小RNA（microRNA，miRNA）是一种小分子单链非编码RNA，研究提示某些miRNA 可能在脓毒症导致的心功能障碍患者中表达异常，具有潜在作用［5-7］，但关于脓毒症心肌病miRNA 的研究目前仍较少，本研究通过检测血浆miRNA 表达水平，分别对比其在健康人，脓毒症心功能正常患者及脓毒性心肌病患者外周血中的表达情况，筛选出在脓毒症导致心功能不全患者外周血中异常表达的miRNA 并进行分析，以期寻找早期诊断脓毒性心肌病的生物标志物。

材料和方法

1 研究对象

本研究经深圳市人民医院伦理委员会审议同意（编号LL-KY-2019507），根据纳入标准及排除标准随机纳入 2019 年 1 月～2019 年 12 月入住深圳市人民医院重症医学科的患者14 例，根据心功能情况分为脓毒症心功能正常组（8 例）和脓毒性心肌病组（6 例），同时招募健康志愿者6例作为健康对照（healthy control）组。患者及健康志愿者签署知情同意书。

脓毒症诊断标准：符合第三版脓毒症和脓毒症休克定义的国际共识［1］，明确存在感染的患者，SOFA评分急性改变≥2分。

脓毒性心肌病组纳入标准：年龄＞18 周岁，符合脓毒症诊断标准，脓毒性心肌病目前尚无统一标准，本研究采用脓毒症患者LVEF 下降（LVEF＜0.5）作为诊断标准［8］。

排除标准：年龄＜18 周岁；24 h 内可能出院或死亡的患者；合并冠心病或急性心肌梗死患者；存在心脑血管基础疾病患者；存在风湿免疫疾病患者；存在严重神经系统疾病患者；存在血液系统疾病患者；孕产妇；晚期肿瘤患者；存在慢性肝病患者。

2 一般资料

根据患者的LVEF 情况，14 例患者分为心功能正常组（8 例）及脓毒性心肌病组（6 例），两组患者年龄，SOFA 评分，APEACHEII 评分对比无统计学差异（P＞0.05），具体详见表1。

表1 两组患者入组时的一般资料Table 1.General data of patients in both groups at the time of enrolment（Mean±SD）

3 实验方法

所有患者根据纳入标准纳入研究24 h 内取静脉血送本院检验科查cTnI 和CK-MB，同时取静脉血3 mL，贮存于全血RNA 静脉真空采血管（BD 762165 PAXgen）。NanoDropTMOne/OneC 检测 RNA 纯度，Life Invitrogen Qubit®3.0 荧 光 定 量 仪 采 用 QubitTMRNA HS Assay Kit精确定量测量RNA；Agilent 4200 TapeS-tation 系统精确检测RNA 的完整性。利用small RNA的3‘端及5’端完整磷酸基团结构，分别在两端连接接头，逆转录合成 cDNA，进行 PCR 扩增，PAGE 胶电泳分离纯化目标DNA片段，获得特定大小small RNA文库。质量检测后，进行测序。参考基因组比对，进行miRNA 分析，miRNA 表达和差异分析，取FDR＜0.05的高表达miRNA。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0进行统计分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 生物标志物情况对比

脓毒性心肌病组与脓毒症心功能正常组两组患者cTnI 和CK-MB 对比，差异无统计学差异（P＜0.05），而脓毒性心肌病组LVEF 较脓毒症心功能正常组显著下降（P＜0.05），见表2。

表2 两组患者生物标志物及LVEF对比Table 2.Comparison of biomarkers and LVEF between the two groups（Mean±SD）

2 芯片检测结果

获得特定大小small RNA 文库，质量检测后，进行测序。参考基因组比对，进行miRNA 分析，miRNA 表达和差异分析，取FDR 小于0.05 的高表达miRNA。应用Cluster 3.0聚类分析，结果见图1、2。

Figure 1.The cluster analysis diagram of healthy control group（n=6）and septic cardiomyopathy group（n=6）.图1 健康对照组及脓毒性心肌病组聚类分析图

Figure 2.The cluster analysis diagram of healthy control group（n=6）and normal heart function with sepsis group（n=8）.图2 健康对照组及脓毒症心功能正常组聚类分析图

3 血浆miRNAs的表达情况

与健康对照组相比，脓毒症心功能正常组有105种miRNAs 表达上调，而脓毒性心肌病组有45 种miRNAs 表达上调，两组中表达明显上调的20 种miRNAs 列表分别见表3、4。其中，脓毒症心功能正常组及脓毒性心肌病组miR-122-5p表达上调均显著高于其他的miRNA，见图3、4。

表3 与健康对照组对比，脓毒症心功能正常组表达上调的miRNAs前20种列表Table 3.The top 20 miRNAs up-regulated in normal heart function with sepsis group compared with healthy control group

表4 与健康对照组对比，脓毒性心肌病组表达上调的miRNAs前20种列表Table 4.The top 20 miRNAs up-regulated in septic cardiomyopathy group compared with healthy control group

Figure 3.The volcano plot of septic cardiomyopathy group（n=6）. Padj：adjusted P value；FC：fold change.图3 脓毒性心肌病组火山图

Figure 4.The volcano plot of normal heart function with sepsis group（n=8）. Padj：adjusted P value；FC：fold change.图4 脓毒症心功能正常组火山图

3 同一miRNA 在脓毒症心功能正常组与脓毒性心肌病组外周血浆中表达情况的对比

与健康对照组相比较，同一miRNA 在两组中均表达上调，且脓毒性心肌病组较脓毒症心功能正常组表达显著升高的5 种miRNAs 分别为miR-122-5p，miR-122b-5p，miR-122-3p，miR-122b-3p 和 miR-885-5p，其中，与健康对照比较，在脓毒性心肌病患者中的miR-122-5p表达升高的倍数是脓毒症心功能正常组患者的两倍以上，见图5。

Figure 5.The5miRNAs that were significantly up-regulated in septic cardiomyopathy group compared with septic normal heart function with sepsis group.图5 脓毒性心肌病组较脓毒症心功能正常组表达显著升高的5种miRNAs

讨 论

脓毒症尤其是脓毒性休克时，潜在的炎症过程通常伴有血液动力学障碍，从而导致组织灌注减少和细胞供氧减少，加剧了终末器官损害，而器官衰竭，尤其是心功能障碍是脓毒症导致死亡的主要原因［9］。心肌收缩力受损，射血分数降低，舒张期顺应性下降等是脓毒性心肌病的主要表现，其确切的病理生理过程目前仍不明确，亦没有特效药物能够给予预防［10］，目前仍缺乏早期诊断脓毒性心肌病的有效生物学指标。

某些miRNA 在健康的心脏组织中高度表达，可能在维持正常心脏功能中起作用（如miR-1，miR-16，miR-27b，miR-30d，miR-126，miR-133 和 miR-143等）［11］。由于脓毒症导致的心功能障碍涉及到多种病理生理过程，可出现多种miRNA 表达水平失衡，多项研究提示异常表达的miRNA 在脓毒性心肌病发展中具有重要的调节作用，可以帮助诊断，判断预后。近期的一项研究显示内毒素（lipopolysaccharide，LPS）引起的脓毒症休克大鼠心肌中有78 种miRNA 存在差异表达，其中miR-155-3p 增加了2.8倍，miR-155-5p 上调了 1.9 倍［12］，抑制 miR-155 可减轻LPS诱导的小鼠心功能障碍和细胞凋亡［6］，研究显示，miR-155-5p 及miR-133-3p 在脓毒症心肌损伤组患者血浆中表达显著升高［13］，有助于早期诊断脓毒性心肌病。另外，目前体内及体外的研究证实其他的几种miRNA 的表达失调，如 miR-146a，miR-125b，miR-21-3p和miR-23b等可以加重炎症和脓毒症诱导的心脏功能障碍［14］；脓毒症患者血浆 miR-499 水平与LVEF 负相关，与血cTnI 水平正相关，可反映脓毒症合并心肌损伤病情的严重程度［15］。

本研究通过对比观察脓毒性心肌病患者、脓毒症心功能正常患者与正常人群之间miRNAs 的差异表达谱，显示与健康对照组相比，多种miRNA 在脓毒症患者外周血浆中表达均显著增高，但与上述国内外研究结果不同的是，脓毒性心肌病组较脓毒症心功能正常组表达升高显著的5 种miRNA 分别为miR-122-5p，miR-122b-5p，miR-122-3p，miR-122b-3p和 miR-885-5p，miR-122 尤其是 miR-122-5p，其升高的倍数是脓毒症心功能正常患者的两倍以上。而既往的研究显示循环miR-122 是一种组织特异性RNA，几乎占所有肝脏miRNA 的70%，在其他组织中的表达较少［16］，主要在肝癌术前及病毒性肝炎患者血清中升高［17］，其血清浓度的变化还与炎症性疾病和脓毒症引起的急性肝功能障碍有关［18-20］；与健康对照组相比，miR-122表达的改变可能被用作脓毒症诊断的生物标志物［21］，Rahmel 等［22］的研究显示升高的miR-122 血清浓度有助于区别普通感染和脓毒症，是30 d 死亡的早期和独立的危险因素，miR-122的表达与脓毒症患者平均动脉压和去甲肾上腺素剂量之间存在显著相关性，但目前尚未见miR-122 尤其是miR-122-5p 在脓毒性心肌病中的报道。另外，我们研究显示的另一个重要意义是，当传统的临床标志物如cTnI 及CK-MB 无显著统计学差异时，miR-122 表达水平高低可能可以更早区分出脓毒症患者被掩盖的心功能下降，这些miRNA 有可能成为早期诊断脓毒性心肌病的生物标志物。

因此，相较于传统的临床标志物，miR-122 尤其miR-122-5p 在脓毒性心肌病患者血浆中表达显著升高，可能成为早期诊断脓毒性心肌病的生物标志物，有助于早期诊断。但本研究仍存在局限性，首先，本研究旨在初步了解脓毒性心肌病患者血浆miRNAs有无存在异常表达，仅纳入脓毒症心功能正常患者8例及脓毒性心肌病患者6 例进行血浆miRNAs 分析，尽管基础病方面已排除了大量具有合并相关疾病的患者，且两组患者年龄、SOFA 评分，APEACHEII 评分对比无显著差异，尽可能排除了基础病、年龄、疾病严重程度、器官功能损害情况等对血浆miRNA 表达的影响，但两组标本较少，未能将两组患者的其它临床资料与miRNA 进行多因素风险分析，同时未能对不同严重程度脓毒性心肌病患者进行分组研究，亦未能进一步进行ROC 曲线分析异常表达的miRNA 水平在脓毒性心肌病中的诊断价值；其次本研究未动态监测异常表达miRNA 的水平变化，未能进一步阐述其在患者病情发生发展中的动态改变。最后，异常表达的miRNA 参与脓毒症心肌损伤的病理机制仍不清楚。我们的研究结果仍需要在具有大量队列的前瞻性研究中得到验证，在未来的研究中，我们将扩大样本量，同时争取从同一患者获得多个时间点样本来确定基因表达水平的动态改变，进一步明确异常表达的miRNA 与脓毒性心肌病发生发展的相关性及可能的致病机制。