缺氧诱导因子通过FOXC1促进脑胶质瘤细胞侵袭*

陈 威， 彭 灿， 励 勇， 章建飞， 王新东△

（1宁波大学医学院附属医院神经外科，浙江宁波315211；2宁波市临床病理诊断中心，浙江宁波315021）

恶性胶质瘤细胞侵袭正常脑组织是造成胶质瘤不良预后的主要原因之一［1］，但胶质瘤的侵袭性机制仍待进一步探索。众所周知，缺氧微环境是胶质母细胞瘤的特征之一，缺氧可诱导胶质母细胞瘤细胞的上皮-间充质转换，导致肿瘤细胞形态学改变［2］，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是与缺氧相关的最重要的转录因子［3-4］。HIF 转录因子有助于肿瘤细胞适应缺氧，在许多恶性肿瘤的研究中发现通过缺氧条件的诱导，会使HIF-2α 蛋白表达水平上调，使肿瘤细胞适应缺氧，从而促进肿瘤的发生发展［5-6］。据报道，HIF-2α 在恶性胶质瘤的化疗耐药性中也起着至关重要的作用［7］，但具体机制还不甚清楚。转录因子叉头框蛋白C1（forkhead box C1，FOXC1）属于叉头框转录子基因家族的一员［8-9］。国内有文献报道，通过过表达FOXC1 后，会促使胶质瘤细胞的侵袭能力明显增强［10］，但缺氧条件是否能影响胶质瘤细胞中FOXC1 的表达，进而影响胶质瘤细胞的生物学特性暂无文献报道。

本实验初步探讨了在缺氧情况下FOXC1 在胶质瘤细胞中的表达情况及HIF 对其表达的影响，进一步阐明HIF-2α 与FOXC1之间的关系，为临床治疗胶质瘤提供新的靶点和理论依据。

材料和方法

1 材料

人脑胶质瘤细胞系U87 购于ATCC；人脑胶质瘤细胞系U251 获得于日本理化研究中心。BCA 蛋白浓度测定试剂盒、I 抗稀释液、超敏ECL 化学显色剂和Tween-20 购自江苏碧云天公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco；0.25%胰蛋白酶、高糖DMEM 培养基购自HyClone；二甲基亚砜（dimerthyl suifoxide，DMSO）购于北京索莱宝公司；Trizol Regent 试剂购于 Ambion；小鼠抗人 β-actin 单克隆抗体、小鼠抗人FOXC1 单克隆抗体、小鼠抗人HIF-1α 单克隆抗体、兔抗人 HIF-2α 多克隆抗体、兔抗人N-cadherin 多克隆抗体、小鼠抗人vimentin 单克隆抗体和小鼠抗人E-cadherin 单克隆抗体等均购自Abcam；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 购于武汉普美克生物有限公司；FOXC1和GAPDH的PCR引物购于上海生工生物工程技术服务有限公司；小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰序列购自上海吉玛公司；Transwell 小室购自Millipore；基质胶购于Sigma。PCR分析仪和电泳仪装置购于Amersham；凝胶成像系统购自Bio-Rad。

2 主要方法

2.1 细胞培养 U87 和U251 细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM 培养基中培养。阴性对照组在37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养，取对数生长期胶质瘤细胞置于缺氧培养箱（37 ℃、5% CO2、1% O2、94% N2）进行培养，缺氧培养的时间分别为3、12、24和48 h。并以CoCl2模拟缺氧条件，取24 孔板，每孔中接种1×104个对数生长期的胶质瘤细胞，培养24 h后，弃去原培养液，加入含CoCl2的细胞培养液，CoCl2的浓度分别为0、100、150、200和250 μmol/L，继续培养24 h，再进行细胞RNA或者蛋白的提取。

2.2 细胞转染 将U87 和U251 细胞接种到6 孔板中，当细胞生长状态良好、融合度达60%～70%时，换为无胎牛血清的DMEM 培养液静置24 h，使细胞生长同步化，24 h后换为含有2%胎牛血清的DMEM 培养基。计算所需要转染的siRNA 的量，在200 μL DMEM 培养基中分别加入5μL siRNA 以及 8 μL 的Lipofectamine 2000，使其充分混匀；室温下静置18 min后加入细胞中；再按实验需求放入相对应的正常氧或缺氧培养箱中培养，当转染48 h后，方可行细胞RNA或者蛋白的提取。

2.3 Western blot 法检测 U87 和 U251 瘤细胞中 HIF-1α、HIF-2α、FOXC1、N-cadherin、E-cadherin 和vimentin 的蛋白水平 吸弃细胞培养液，PBS 清洗3 次，吸净残余液体，6 孔板每孔中加120 μL 裂解液，置于冰上裂解5 min，用细胞刮充分刮取，将细胞裂解物收集到 1.5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r/min 离心 20 min，提取上清液，加入5×上样缓冲液，煮沸后经SDSPAGE 分离蛋白；上胶恒压 80 V，42 min，下胶恒压120 V，65 min。转膜恒流300 mA、60 min；50 g/L脱脂牛奶常温封闭1 h。TBST 洗膜后，分别加小鼠抗人β-actin 抗体（1∶4 000）、小鼠抗人FOXC1 单克隆抗体（1∶1 000）、小鼠抗人HIF-1α 单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗人HIF-2α 多克隆抗体（1∶1 000）、兔抗人N-cadherin 多克隆抗体（1∶1 000）、小鼠抗人vimentin 单克隆抗体（1∶1 000）、小鼠抗人E-cadherin 单克隆抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；回收Ⅰ抗，TBST洗涤后，分别加入相应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG或辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶3 000），室温孵育1 h，TBST洗涤3次后用增强化学发光法显色，经Bio-Rad凝胶成像系统曝光，用Image Lab 6.1软件分析图像。

2.4 Transwell 侵袭和迁移实验检测 U87 和 U251 细胞的侵袭能力 按试剂盒说明书操作，进行基质胶的制备：从-80 ℃冰箱中提前将Matrigel 胶取出后放至4 ℃的冰箱过夜，使其由固态变为液态；将液态的Matrigel 胶和无血清培养基充分混匀，混匀体积比为1∶3，将体积为 80 μL 的 Matrigel 胶稀释后加入到上室，使其均匀的铺至上室的底部，放入37 ℃的培养箱，使得Matrigel 胶凝固。用移液吸枪将细胞悬液加入铺有Matrigel 胶的Transwell 小室的上室中，量约200 μL。将 Transwell 小室放至 24 孔板中，孔板内形成Transwell 的下室，在每个Transwell 小室的下室加入500 μL 含有20%胎牛血清的DMEM 高糖培养基，再将小室放至37 ℃的细胞培养箱进行孵育。经过24 h 的孵育后，将小室从细胞培养箱中取出，用洁净的医用棉签将小室上室中的细胞轻轻拭去，用PBS缓冲液将Transwel 小室的上室清洗3 次，用4%的多聚甲醛固定细胞20 min，再用PBS 缓冲液洗涤3 次。将小室内的细胞用0.1%的结晶紫染色20 min，然后用PBS 缓冲液反复冲洗3 次，用显微镜取3 个独立的视拍野照计数，计算平均值。

2.5 RT-qPCR检测FOXC1的mRNA水平 用Trizol 试剂从细胞中提取总RNA。然后根据RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作逆转录合成cDNA。逆转录之后获得的cDNA 按照天根SuperReal荧光定量预混试剂盒的20 μL 体系操作，按照 2-ΔΔCt方法计算 RNA 的相对表达量。使用引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3 统计学处理

采用SPSS 13.0 统计软件统计分析数据。计数资料用均数±标准差（mean±SD）表示。每组实验均独立重复3 次。多组间的比较使用单因素方差分析，方差分析后各组均数间使用q检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 在胶质瘤细胞系中，FOXC1、HIF-1α 和HIF-2α随缺氧时长增加及加入CoCl2浓度的增加而表达逐步上升

为了探寻缺氧环境下FOXC1 在胶质瘤细胞系中的表达水平，分别在正常氧条件下及缺氧3、12、24和48 h 条件下培养胶质瘤细胞系U87 和U251，通过RT-qPCR 检测 FOXC1 的 mRNA 表达，通 过 Western blot 实验检测 HIF-1α、HIF-2α 及 FOXC1 蛋白的表达水平。Western blot 结果显示，在胶质瘤细胞系U87和U251 中，缺氧条件下HIF-1α、HIF-2α 和FOXC1 蛋白表达水平与正常氧条件相比均明显升高（P＜0.05），见图 1A。RT-qPCR 结果显示，在缺氧条件下，在胶质瘤细胞系U87 和U251 中FOXC1 的mRNA表达水平与正常氧条件相比均明显升高，且随缺氧时间延长，FOXC1 的 mRNA 表达逐步升高（P＜0.05），见图1B。应用HIF 诱导剂CoCl2模拟缺氧条件，发现CoCl2处理的胶质瘤U87 和U251 细胞系中FOXC1 的 mRNA 表达水平及 FOXC1、HIF-1α 和 HIF-2α 的蛋白表达水平均较阴性对照组明显升高，且升高水平与加入CoCl2的浓度呈正相关（P＜0.05），见图1C、D。这些实验结果证实缺氧环境能诱导FOXC1的表达，HIF-1α 和 HIF-2α 可能参与缺氧环境下FOXC1的表达上调。

Figure 1.The expression of FOXC1 at mRNA and protein levels，and the protein levels of HIF-1α and HIF-2α in the glioma U87 cells and U251 cells under normoxic and hypoxic conditions.A，C：the images and quantitative analysis by Western blot for determining the protein levels of HIF-1α，HIF-2α and FOXC1；B，D：the mRNA expression of FOXC1 detected by RT-qPCR detection.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 0 μmol/L CoCl2 group.图1 常氧和缺氧环境下，FOXC1、HIF-1α和HIF-2α在胶质瘤细胞中的表达

2 缺氧环境下HIF-2α上调FOXC1的表达水平

为了探寻 HIF-1α 和 HIF-2α 在缺氧环境下对FOXC1 表达水平的影响，我们在胶质瘤细胞系U87和 U251 中分别敲减HIF-1α和HIF-2α的表达水平，通过Western blot 实验发现，正常氧条件下，转染HIF-1αsiRNA（siHIF-1α）和HIF-2αsiRNA（siHIF-2α）后，细胞中FOXC1 蛋白的表达水平无明显变化。而转染 siHIF-1α 后，缺氧条件下细胞中HIF-1α 蛋白表达较对照组明显降低（P＜0.05），而FOXC1 蛋白的表达水平无明显变化（图2A）；但在转染siHIF-2α后，缺氧条件下培养的胶质瘤细胞中FOXC1 以及HIF-2α 的蛋白表达水平均较阴性对照组下降（P＜0.05），见图2B。进一步证实缺氧环境下FOXC1 的上调与HIF-2α表达相关。

Figure 2.Western blot was used to detect the protein expression of FOXC1 under hypoxia when knock-down of HIF-1α and HIF-2α in glioma cell lines U87 and U251 after transfection of HIF-1α siRNA（A）and HIF-2α siRNA（B），respectively.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs hypoxia group.图2 缺氧环境下，分别敲减胶质瘤细胞中HIF-1α或HIF-2α表达后的FOXC1蛋白的表达变化

3 缺氧环境下下调FOXC1表达水平抑制胶质瘤细胞侵袭能力

分别在常氧和缺氧条件下培养胶质瘤细胞系U87和U251，Transwell实验发现，与常氧条件下相比，缺氧条件下胶质瘤细胞系侵袭能力明显增强；缺氧条件下转染FOXC1siRNA（siFOXC1）后，与缺氧组相比侵袭能力明显减弱（P＜0.05），见图3A。通过Western blot 实验继续探寻缺氧环境下FOXC1 与细胞上皮间质化转录因子 N-cadherin、E-cadherin 和 vimentin 的关系。如图3B 所示，胶质瘤细胞系U87和U251在缺氧环境下，与常氧环境相比，间质化标记蛋白N-cadherin和vimentin表达明显上升，而上皮标记蛋白E-cadherin的表达明显下降（P＜0.05）；缺氧环境下，敲减FOXC1的表达会降低N-cadherin和vimentin表达，升高E-cadherin 的表达（P＜0.05）。这些结果说明在缺氧条件下，FOXC1的表达变化与肿瘤的侵袭能力息息相关。

Figure 3.The changes of the invasive ability and the protein expression of N-cadherin，E-cadherin and vimentin in U87 and U251 cells with knock-down of FOXC1 expression.A：representative images and quantitative analysis showed that the invasive ability of glioma cell lines U87 and U251 was changed after knock-down of FOXC1 expression under normoxic and hypoxic conditions（×200）；B：Western blot was used to detect the changes of FOXC1，N-cadherin，E-cadherin and vimentin protein levels in glioma cell lines U87 and U251 after knock-down of FOXC1 expression under normoxic and hypoxic conditions.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normoxia group；#P＜0.05 vs hypoxia group.图3 缺氧环境下，敲减FOXC1表达后胶质瘤细胞的侵袭能力以及N-cadherin、E-cadherin和vimentin蛋白表达的变化

讨 论

脑胶质瘤是来源于神经上皮的一种最常见的肿瘤，占所有原发性脑和中枢神经系统肿瘤的24%［11］。尽管目前对脑胶质瘤的治疗方法取得了很大的进展，但是由于恶性胶质瘤侵袭能力强这一特点导致外科治疗及放化疗后肿瘤容易复发，以至于患者的预后仍极差，胶质瘤的总体治疗效果并不理想［12-14］。因此当前对于抑制胶质瘤细胞高度侵袭能力的相关研究迫在眉睫。

肿瘤生长的微环境中缺氧是其一个基本的特征［15-16］。肿瘤细胞在低氧条件下可以通过激活适应性反应继续存活［17-18］。缺氧诱导因子是与缺氧相关的最重要的转录因子，在缺氧条件下，起着传递缺氧信号、介导缺氧效应的重要作用［19-20］。HIFs 是一个异二聚体复合物，由 HIF-α 和 HIF-β 组成，HIF-β 是一个稳定的亚基，HIF-α 是亲氧亚基［21-22］。哺乳动物的 HIF-α 有 3 种 亚型 ，即 HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α［3-4］。目前研究表明 HIF-2α 的高度表达与乳腺癌和小细胞肺癌的侵袭及转移有关，其机制可能是HIF间接或直接诱导上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［23］。HIF-2α过度表达也是预测肝癌、大肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、脑部肿瘤和卵巢癌等恶性肿瘤不良预后的重要相关标志物［24］。

叉头框（forkhead box，FOX）家族成员的分子结构都有一个明显的叉头和螺旋翼状DNA 结合区域，其是录转因子的大家族，家族成员众多，参与调控基因的表达，与细胞的生长周期、增殖、分化、迁移、新陈代谢、DNA 的损伤应答及肿瘤的发生发展有着重要的关系［25-27］。人类叉头框基因家族成员的命名从FOXA 到 FOXS，有着不同的功能与结构［28］。转录因子FOXC1 属于叉头框转录子基因家族的一员［8-9］。目前FOXC1 蛋白的功能还不是十分清楚，现已有文献报道FOXC1 的表达缺失可促进上皮性卵巢癌发生 EMT［29］。国内有文献报道，过度表达 FOXC1 后胶质瘤细胞的侵袭能力明显增强［10］，但其具体机制还不甚清楚。

本实验中，与常氧培养相比，缺氧环境下培养的胶质瘤细胞的侵袭能力明显增强，FOXC1 的表达水平明显上调，而FOXC1沉默则会降低N-cadherin、vimentin 表达，升高E-cadherin 的表达，抑制了缺氧条件下增强的侵袭能力，证实了FOXC1 的表达与胶质瘤细胞的侵袭能力息息相关。其次发现在胶质瘤细胞中，随缺氧时间的延长以及加入CoCl2浓度的增加，不仅FOXC1 的表达水平不断上调，HIF-1α、HIF-2α 的表达水平也逐步上升，由此，猜想 FOXC1 与HIF-1α、HIF-2α 两者之间存在联系。我们分别转染HIF-1α siRNA 和 HIF-2α siRNA 进行验证，结果显示转染 HIF-1α siRNA 后，FOXC1 蛋白表达水平无明显变化，但在转染HIF-2α siRNA后，缺氧条件下培养的胶质瘤细胞中FOXC1 的蛋白表达水平较阴性对照组下降。证实缺氧环境下FOXC1 的上调与HIF-2α表达相关，进一步验证了缺氧条件下HIF-2α 可以通过调控FOXC1 表达从而改变胶质瘤细胞的侵袭能力，明确了HIF-2α/FOXC1调节轴在缺氧环境下胶质瘤细胞侵袭中的作用。