长链非编码RNA FTH1P3靶向miR-218降低人肺癌顺铂耐药细胞对顺铂的化疗敏感性*

李正雄 王雅棣

肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，也是导致全球肿瘤相关死亡的主要原因之一[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占所有肺癌的85%，据报道NSCLC 患者5年生存率低于15%[2-3]。近年来，NSCLC 的诊断和治疗取得了较大的进展，铂类化疗药物已被用作中晚期患者术后的标准辅助治疗方案。顺铂（cisplatin，DDP）是一种含铂化合物，是临床用于NSCLC 化疗的一线药物[4]。目前，由于NSCLC细胞对DDP 的化疗敏感性降低导致其临床应用受到较大限制并严重影响患者预后。因此，寻找新的途径使NSCLC 耐药细胞重新获得对DDP 的化疗敏感性对于改善患者的临床疗效及预后具有重要意义。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）长度超过200 个核苷酸，无蛋白质编码能力，但能够在转录水平上调节基因表达[5]。迄今为止，研究者们一直在努力阐明lncRNA 在各种疾病发生中的作用和机制[6]。研究发现，lncRNA 可以通过降低细胞生长和增加细胞凋亡而改善耐药肿瘤细胞对DDP 的化疗敏感性[7-8]。本研究前期研究发现，铁蛋白重链1 假基因3（ferritin heavy chain 1 pseudogene 3，FTH1P3）在NSCLC 癌组织和细胞中高表达，并具有促进NSCLC细胞迁移和侵袭及上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的能力[9]。本研究旨在明确FTH1P3 对人肺癌DDP 耐药细胞株（A549/DDP）DDP 化疗敏感性的影响，并探究其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

A549 与A549/DDP 细胞购自美国ATCC 全球生物资源中心。FTH1P3 特异性短干扰RNA（si-FT H1P3）、阴性对照短干扰RNA（si-NC）、miR-218 抑制物、阴性对照（NC）抑制物、miR-218 模拟物、阴性对照模拟物寡核苷酸序列均购自苏州吉玛基因公司。野生型（wt）-FTH1P3 重组报告载体与突变型（mut）-FTH1P3 重组报告载体均购自深圳孜科科学仪器有限公司。RPMI1640 培养基与胎牛血清（FBS）均购自美国Gibco 公司。Opti-MEM 培养基及Lipofectamine 2000 转染试剂均购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。0.25%胰蛋白酶、双抗、3-（4, 5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）与DDP 均购自美国Sigma 公司。TRIzol、PrimeScript™ RT-PCR 与SYBR Premix Ex Taq 试剂均购自北京Takara 公司。膜联蛋白V（Annexin V）-FITC 与碘化丙啶（PI）试剂均购自美国BioLegend 公司。半胱天冬蛋白酶3（Casp3）活性试剂与荧光素酶报告基因检测系统均购自美国Promega 公司。RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）试剂购自美国Millipore 公司。抗人argonaute 2（Ago2）抗体与IgG 抗体均购自美国Abcam 公司。FTH1P3、多药耐药关联蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）、ATP 结合家族亚家族B 成员1（ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）、miR-218、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）与U6 基因特异性引物均购自美国Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 所有细胞采用RPMI1640培养基并添加10% FBS 与1%双抗，放置在37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。为维持A549/DDP 细胞对DDP 的耐药性，在细胞培养时添加2 μM 的DDP。为干扰FTH1P3 与miR-218 的内源性表达，分别合成si-FTH1P3 与miR-218 抑制物，并以si-NC与NC 抑制物为阴性对照，序列信息见表1。将A549/DDP 按5×106/孔接种至6 孔板中。24 h 后，根据Lipofectamine 2000 转染试剂说明书，加入500 μL的 Opti-MEM 培养基将100 nM 的寡核苷酸序列瞬时转染至细胞。6 h 后，弃去培养基，并重新添加新鲜RPMI1640 培养基。48 h 后，用0.25%胰蛋白酶消化分离细胞，收集细胞用于下一步实验。

表1 序列信息

1.2.2 荧光定量PCR 试验 采用TRIzol 试剂从细胞中提取总RNA。采用PrimeScript™ RT-PCR 试剂将1 μg 总RNA 反转录为cDNA。在ABI 7 500 RT-PCR系统中采用SYBR Premix Ex Taq 试剂分析FTH1P3、MRP1、ABCB1 与miR-218 表达。引物序列信息见表2，GAPDH 作为FTH1P3、MRP1 与ABCB1 的内参对照，U6 作为miR-218 的内参对照。反应条件：95℃2 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，40 个循环；72℃ 5 min；4℃30 min。实验独立重复3 次，通过2-ΔΔCt法定量分析FTH1P3、MRP1、ABCB1 与miR-218 表达。

表2 引物序列信息

1.2.3 MTT 法 采用MTT 法分析DDP 对细胞的生长抑制作用。将转染后的A549/DDP 细胞以4×103/孔接种在96 孔板中。12 h 后，采用不同浓度的DDP（0、2、4、8、16、32 和64 μM）处理细胞1 、2 和3 d。将10 μL 的MTT（5 mg/mL）加入每个孔中，并在37℃下孵育4 h。然后加入100 μL 二甲基亚砜使晶体溶解，使用酶标仪在450 nm 下检测各孔光密度（OD）值。实验独立重复3 次，半抑制浓度（IC50）代表抑制一半A549/DDP 细胞生存的DDP 浓度。

1.2.4 流式细胞术 采用流式细胞术检测细胞凋亡。将转染后的A549/DDP 按5×106/孔接种至6 孔板中，在37℃培养48 h，收集细胞。将细胞用PBS 稀释至约1×106/mL，采用75%乙醇在4℃固定过夜。在暗室中37℃用5 μL 膜联蛋白V-FITC 试剂染色20 min，随后加入3 μL 的 PI 试剂染色15 min。最后，在FACScan 流式细胞仪中上样检测，实验独立重复3 次，并用CellQuest Pro 软件分析细胞凋亡率。

1.2.5 Caspase-3 活性试验 采用Caspase-3 活性试验检测细胞凋亡。收集1×106个转染后的A549/DDP细胞，按照Caspase-3 活性试剂说明书加入裂解液裂解细胞并获得蛋白，在37℃加入反应缓冲液孵育30 min，加入底物孵育15 min。采用酶标仪在405 nm下检测各孔OD 值，并计算Caspase-3 活性（实验组OD/对照组OD×100%）。

1.2.6 Hoechst 33 258 染色试验 采用Hoechst 33 258染色试验观察细胞凋亡。将转染后的A549/DDP 细胞按7×104/孔接接种至24 孔板的细胞爬片中，在37℃培养48 h，取出爬片。加入1 μL 的Hoechst 33 258在37℃下染色3 min，封片并在荧光显微镜下观察凋亡细胞。

1.2.7 荧光素酶报告基因试验 使用StarBase v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）数据库预测FTH1P3 转录本序列与miR-218 序列之间的结合位点。将A549/DDP 按3× 105/孔接种至12 孔板中，24 h 后，加入Lipofectamine 2000 转染试剂瞬时共转染500 ng wt-FTH1P3 或mut-FTH1P3 重组报告载体（表达萤火虫荧光素酶），50 ng pRL-TK（表达海肾荧光素酶）和25 μM miR-218 抑制物与NC 抑制物或25 μM miR-218 模拟物与NC 模拟物。48 h 后，采用荧光素酶报告基因检测系统检测萤火虫与海肾荧光素酶值。以海肾荧光素酶值为参照，并计算相对荧光素酶活性（萤火虫荧光素酶值/海肾荧光素酶值×100%）。

1.2.8 RIP 试验 收集约106个A549/DDP 细胞，按照RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂说明书使用含有蛋白酶抑制剂和RNA 酶抑制剂的RIP 裂解液裂解细胞。将得到的细胞提取物与抗人Ago2 抗体或IgG 抗体与RIP 缓冲液一起孵育1 h，随后经磁珠处理。用蛋白酶K 消化蛋白质，提取免疫沉淀的RNA 进行荧光定量PCR 并检测FTH1P3 表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。实验结果表示采用±s，两组均数之间的比较采用t检验，多组均数之间比较采用单因素方差分析和Tukey 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 A549/DDP 细胞中FTH1P3 表达上调而miR-218 表达下调

与A549 细胞相比，A549/DDP 细胞经DDP 处理1、2 及3 d 后，IC50分别升高至（3.71±0.42）倍、（3.92±0.35）倍与（4.56±0.60）倍（均P＜0.01，图1A）；A549/DDP 细胞中耐药基因MRP1 和ABCB1 mRNA表达水平显著增加（均P＜0.05，图1B）；A549/DDP 细胞中FTH1P3 表达水平显著上调（P＜0.01，图1C），而miR-218 表达水平显著下调（P＜0.05，图1D）。

2.2 干扰FTH1P3 增加A549/DDP 细胞对DDP 的化疗敏感性

与si-NC 相比，si-FTH1P3 转染显著抑制A549/DDP 细胞中FTH1P3 表达（P＜0.001，图2A）；si-FTH 1P3 转染A549/DDP 细胞经DDP 处理1、2 及3 d 后，IC50分别降低至（0.73±0.15）倍、（0.55±0.19）倍及（0.48±0.06）倍（均P＜0.05，图2B）；si-FTH1P3 转染A549/DDP 细胞中MRP1 和ABCB1 基因mRNA 表达显著降低（均P＜0.05，图2C）。

2.3 干扰FTH1P3 降低A549/DDP 细胞生长能力并促进细胞凋亡

与si-NC 相比，si-FTH1P3 转染A549/DDP 细胞1、2 及3 d 后，细胞生长能力显著降低（P＜0.05，图3A）。与si-NC 相比，si-FTH1P3 转染A549/DDP细胞凋亡率（P＜0.001，图3B）、单个视野下细胞凋亡数（P＜0.01，图3C）及Caspase-3 活性（P＜0.05，图3D）均显著升高。

2.4 FTH1P3 直接结合miR-218 并抑制其表达

生物信息学分析显示，FTH1P3 转录本中AAG CACA 序列可直接与miR-218 中UUCGUGU 序列结合（图4A）。与NC 抑制物相比，miR-218 抑制物转染显著抑制A549/DDP 细胞中miR-218 表达（P＜0.05），与NC 模拟物相比，miR-218 模拟物转染显著促进A549/DDP 细胞中miR-218 表达（P＜0.001），见图4B。与NC 抑制物相比，miR-218 抑制物转染显著增加wt-FTH1P3 重组报告载体的相对荧光素酶活性（P＜0.05），但对mut-FTH1P3 重组报告载体的相对荧光素酶活性无明显影响P＞0.05）；与NC 模拟物相比，miR-218模拟物转染显著降低wt-FTH1P3 重组报告载体的相对荧光素酶活性（P＜0.05），但对mut-FTH1P3 重组报告载体的相对荧光素酶活性无明显影响（P＞0.05），见图4C。与抗IgG 抗体相比，抗Ago2 抗体显著增加A549/DDP 细胞中FTH1P3 富集（P＜0.001，图4D）。与si-NC 相比，si-FTH1P3 显著促进A549/DDP 细胞中miR-218 表达（P＜0.05，图4E）。

2.5 干扰miR-218 逆转经si-FTH1P3 处理的A549/DDP 细胞对DDP 的化疗敏感性

与NC 抑制物相比，miR-218 抑制物转染显著降低经si-FTH1P3 处理的A549/DDP 细胞中miR-218表达（P＜0.05，图5A）；miR-218 抑制物转染经si-FTH1P3 处理的A549/DDP 细胞经DDP 处理1 、2 及3 d 后IC50分别升高至（1.14±0.12）倍、（1.23±0.14）倍及（1.36±0.10）倍（均P＜0.05，图5B）；miR-218 抑制物转经染si-FTH1P3 处理的A549/DDP 细胞中MRP1和ABCB1 基因mRNA 表达水平显著升高（均P＜0.05，图5C）；miR-218 抑制物转染经si-FTH1P3 处理的A549/DDP 细胞1、2 及3 d 后细胞生长能力显著升高（P＜0.05，图5D）。与NC 抑制物相比，miR-218 抑制物转染经si-FTH1P3 处理的A549/DDP 细胞凋亡率（图5E）、单个视野下细胞凋亡数（图5F）及Caspase-3活性（图5G）均显著降低（均P＜0.05）。

图2 干扰FTH1P3 对A549/DDP 细胞DDP 化疗敏感性的影响

图3 干扰FTH1P3 降低A549/DDP 细胞生长能力并促进细胞凋亡

图4 FTH1P3 对miR-218 的调控作用分析

图5 干扰miR-218 逆转经si-FTH1P3 处理的A549/DDP 细胞对DDP 的化疗敏感性

3 讨论

目前，NSCLC 细胞对DDP 的耐药问题日益严重，已成为患者临床化疗中面临的主要障碍之一[10]。因此，如何使耐药NSCLC 细胞重新获得对DDP 的化疗敏感性是迫切需要解决的问题。研究发现，部分lncRNA参与调节恶性肿瘤细胞的化疗耐药性[11]。如Long 等[12]研究发现，长停滞特异性基因产物5（growth-arrestspecific 5，GAS5）通过E2F4-PARP1-MAPK 信号轴降低上皮性卵巢癌对DDP 的化疗耐药性。Ge 等[13]证实干扰FOXD2 反义链RNA 1（FOXD2 adjacent opp osite strand RNA 1，FOXD2-AS1）通过miR185-5p/SIX1轴降低NSCLC 细胞对DDP 的化疗耐药性。Yang等[14]揭示尿路上皮癌相关蛋白1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）通过下调miR-513a-5p 提高视网膜母细胞瘤细胞存活率并增强多重化疗耐药性。此外，Cheng 等[15]报道干扰HOX 转录反义RNA（HOX 转录反义RNA，HOTAIR）通过上调miR-34a 抑制PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin 信号通路而降低胃癌细胞对DDP 的化疗耐药性。由此可见，研究lncRNA 在NSCLC 化疗耐药中的作用机制是十分必要的。

FTH1P3 是FHC 基因家族的成员之一，长度为954 个核苷酸，位于人染色体2p23.3 区域。在神经胶质瘤中，FTH1P3 表达上调与细胞增殖和凋亡相关[16]。在子宫颈癌中，FTH1P3 促进HeLa 和SiHa 细胞的增殖、侵袭和迁移[17]。在口腔鳞状细胞癌中，过表达FTH1P3 显著促进肿瘤细胞的体外生长，而沉默FTH1P3 抑制细胞生长[18]。在食管鳞状细胞癌中，干扰FTH1P3 抑制细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力[19]。另有研究发现，FTH1P3 与乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性有关[20]。本课题组前期研究报道，干扰FTH1P3 抑制NSCLC 细胞的迁移和侵袭，并降低EMT，表现为降低N-cadherin、Vimentin 和Snail 蛋白表达，但增加E-cadherin 蛋白表达[9]。本研究发现，FTH1P3 在A549/DDP 细胞表达上调。由此推测，FTH1P3 表达上调可能与A549/DDP 细胞的化疗耐药性有关。通过检测干扰FTH1P3 对A549/DDP 细胞DDP 化疗敏感性的影响，发现干扰FTH1P3 增加A549/DDP 细胞对DDP 的化疗敏感性，表现为IC50降低，MRP1 和ABCB1 mRNA 表达降低；同时A549/DDP细胞生长能力降低、细胞凋亡增加及Caspase-3 活性升高。上述结果表明，FTH1P3 在A549/DDP 细胞中表达上调，FTH1P3 降低A549/DDP细胞对DDP 的化疗敏感性。

研究发现，miR-218 在多种肿瘤组织中表达下调，并发挥抑癌作用[21]。另有研究表明，miR-218 增加肿瘤细胞对DDP 的化疗敏感性，包括食道癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌等[22-25]。本研究发现miR-218 在A549/DDP 细胞表达下调，与Xie 等[26]研究结果一致。此外，干扰FTH1P3 增加A549/DDP 细胞中miR-218 表达。lncRNA 通过充当miRNA 的分子海绵而发挥调控miRNA 的作用机制[27]。如RP11-838N2.4通过充当分子海绵抑制miR-10a 增加胶质母细胞瘤细胞对替莫唑胺的化疗敏感性[28]，沉默LINC00707 通过充当分子海绵抑制miR-145 增强NSCLC 耐药细胞对DDP 的化疗敏感性[29]，由此推测FTH1P3 可能通过分子海绵方式调控miR-218 表达。荧光素酶报告基因和RIP试验证实，FTH1P3 转录本中AAGCACA 序列可直接与miR-218 中UUCGUGU 序列结合。目前已有研究报道，沉默miR-218 增加A549/DDP 细胞对DDP 的耐药性[30]。本研究发现，干扰miR-218 逆转经si-FTH1P3 处理的A549/DDP 细胞对DDP 的化疗敏感性，表现为IC50升高，MRP1 和ABCB1 基因mRNA表达上调，细胞生长能力升高、凋亡细胞减少及Caspase-3 活性降低。上述结果与以往报道结果一致，表明干扰miR-218 降低A549/DDP 细胞对DDP 的化疗敏感性，并进一步证实FTH1P3 通过充当分子海绵下调miR-218 表达从而降低A549/DDP 细胞对DDP的化疗敏感性。

综上所述，本研究发现FTH1P3 在A549/DDP 细胞中表达上调，FTH1P3 靶向miR-218 降低A549/DDP 细胞对DDP 的化疗敏感性。此外，本研究存在一定的局限性。首先，仅在A549/DDP 细胞中检测干扰FTH1P3 对A549/DDP 细胞DDP 化疗敏感性的影响，未在其他NSCLC 耐药细胞株中进行验证。其次，FTH1P3 不仅局限于调控miR-218，还存在调控其他的miRNA。再者，尽管miR-218 是FTH1P3 的分子海绵，但尚未鉴定其下游靶基因。最后，尚未能在动物模型中证实本次研究结果。因此，本课题组下一步计划将从上述各个方面继续探究FTH1P3 对A549/DDP细胞DDP 化疗敏感性的调控机制。